基因佐剂MIP-1α对编码TgGRA12的DNA疫苗诱导抗弓形虫感染的免疫增强作用

发布时间：2020-10-19 18:51

　　 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫,是一种专性细胞内寄生的原虫,它可以感染几乎所有的温血动物(包括人类),引发人兽共患弓形虫病。免疫功能正常的个体感染弓形虫后一般无明显症状,或仅表现出轻微流感样症状。孕妇在孕期感染弓形虫,可对胎儿健康造成不良影响,可致流产、畸形、死胎等。弓形虫病是最常见的机会性感染疾病,免疫功能低下的群体感染弓形虫或可导致严重后果,如弓形虫病占AIDS各种机会性感染的10%～30%,可引起脑部局灶性占位性病变。此外,弓形虫病对畜牧业亦可造成严重的经济损失。弓形虫主要有3种分泌细胞器,分别是微线体(microneme)、棒状体(rhoptry)和致密颗粒(dense granule),三种细胞器分别产生微线体蛋白、棒状体蛋白和致密颗粒蛋白。其中,致密颗粒蛋白对虫体修饰纳虫空泡以及在细胞内生存有重要作用。寄生虫的膜上表达的弓形虫GRA12(TgGRA12)与位于弓形虫纳虫空泡中的膜状纳米管网(MNN)的形成相关,而且TgGRA12在弓形虫的速殖子和缓殖子中都可以表达。巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α),即CCL3,是一种炎性趋化因子,可以促进Th1型细胞分化,诱导分泌更多的细胞因子,产生良好的免疫反应。MIP-1α作为基因佐剂在多种抗病毒DNA疫苗中都有报道,实验证明MIP-1α可增强疫苗的免疫效果。一直以来,DNA疫苗被认为是预防弓形虫感染的有前途的策略。在这项研究中,我们评估了基因佐剂MIP-1α联合TgGRA12的DNA疫苗诱导的免疫保护效果。目的:弓形虫疫苗优秀靶点需要在众多候选蛋白中进行选择。对TgGRA12蛋白进行生物信息学分析,为该蛋白作为弓形虫DNA疫苗的可能性提供理论依据。预测TgGRA12蛋白的基本特性,分析其潜在Th、B细胞抗原表位,并与经典靶点SAG1进行比较,确认其作为新靶点的优势。构建真核表达载体,联合基因佐剂MIP-1α免疫小鼠评估DNA疫苗的保护效果,为寻找新的弓形虫疫苗靶点以及更有效的佐剂提供指导。方法:通过生物信息学分析的方法,利用DNASTAR和IEDB分析软件分别预测TgGRA12蛋白的二级结构、潜在B细胞表位以及Th细胞抗原表位,并与经典靶点蛋白SAG1进行比较。扩增TgGRA12和MIP-1α的基因片段,以真核表达质粒pBudCE4.1为载体,构建重组基因疫苗pBudCE4.1-TgGRA12(pBud-TgGRA12)以及重组基因佐剂pBudCE4.1-MIP-1α(pBud-MIP-1α),最后通过酶切和测序进行验证。将昆明小鼠随机分为5组,分别为疫苗组(pBud-TgGRA12组)、佐剂组(pBud-MIP-1α组)、疫苗+佐剂组(pBud-TgGRA12+pBud-MIP-1α组,即pBud-TgGRA12+pBud-MIP-1α组)、空质粒组(pBudCE4.1组)和空白对照组(PBS组)。小鼠每两周免疫一次,共免疫三次,随后检测特异性IgG和细胞因子产物。用7.gondii RH菌株速殖子进行攻击并记录存活时间以评价疫苗的免疫效果。结果:TgGRA12蛋白的二级结构和潜在B细胞表位以及潜在Th细胞表位与SAG1蛋白相比皆有较明显的优势,这些分析结果为后续实验提供理论基础。成功构建DNA疫苗和基因佐剂后免疫小鼠评估免疫保护效果。与对照组(PBS组和pBudCE4.1组)相比,疫苗组小鼠产生显著强烈的体液应答和Th1型细胞免疫应答,并且抗体和细胞因子的滴度显著增加(P0.05)。与疫苗组相比,联合注射pBud-MIP-1α显著增强了体液和细胞免疫应答(P0.05)。生存实验表明,疫苗+佐剂组小鼠存活时间最长,与疫苗组或佐剂组相比,小鼠的存活时间显著延长(P0.05)。单独佐剂组不能产生有效的体液免疫保护,但可以辅助DNA疫苗诱导更强的Th1型细胞分化。DNA疫苗诱导免疫保护的能力很强,免疫的小鼠感染速殖子后的存活时间延长。结论:生物信息学分析结果表明TgGRA12具有良好的T、B细胞抗原表位,理论上是刚地弓形虫DNA疫苗的有效靶点。通过动物实验也证明TgGRA12能诱导良好的保护性免疫应答,而DNA疫苗联合基因佐剂免疫小鼠引发了最高水平的免疫保护效力,疫苗接种后的小鼠对弓形虫强毒株感染产生较高水平的免疫保护,因此TgGRA12蛋白是针对急性弓形虫病的一种有前途的候选疫苗,MIP-1α作为基因佐剂可增强弓形虫DNA疫苗的免疫效果,为寻找新型佐剂提供了更多选择。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

结果如图１所示，ＴｇＧＲＡ１２蛋白二级结构中ａ螺旋、ｐ折叠、（３转角和无规??则卷曲分别有２０个、３１个、２２个和１３个，ＴｇＳＡＧｌ蛋白中上述二级结构的数??量分别为１４个、１９个、１９个和１１个。蛋白质的二级结构中Ｐ－转角和无规则卷??曲处更易形成抗原表位，是决定蛋白质抗原性的关键结构，ＴｇＧＲＡ１２蛋白的ｐ－??转角和无规则卷曲都多于ＴｇＳＡＧｌ蛋白，表明ＴｇＧＲＡ１２具有良好的抗原性。??５Ｃ３１ｃ?｜?Ｉ?？?Ｉ?Ｉ?ｉｆ?Ｉ?１?Ｉ?｜?？?Ｉ?Ｉ?｜?Ｉ?｜??２０?４?０?６０?８０?１ＣＤ?１２０?１４０?１?６０?１８０?２００?２２Ｄ?２４０?２６０?２８０?３００?３２０?３４０?３６０?３８０?４〇〇?４２Ｄ??ａ?＿?ｔｍ?■?■?■?ｉ?＾?ｍｍ￣￣？－＾???ＴｇＧＲＡ１２?８??■￣ｍｉ??？－？?＾?画?ｍ——ｍ－??ｔ?—ａ?ｂ?ｍｍ￣￣？?ａ?ｅ?ｉ?￣ｔｅ－ｉ－Ｍ?１?ｍ￣ｉ?？?＜?〇???Ｃ??１?１?１?□?Ｄ—０?□￣ＣＭ?Ｂ?□?Ｑ—Ｏ??Ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?Ｉ??２０?４?０?６?０?８０?１?００?１?２０?１４０?１６０?１?８０?２００?２２０?２４０?２６０?２８０?３００??ａ?■?■＿ｉ＿＿Ｂ—ｍ?ｍｔ—ｍ?■￣ｉ?■?—■■■■■?１??ＴｇＳＡＧｌ?ａ?—Ｈ￣■?■?■?ＢＢ－Ｓ－ＯＨｉ?￣Ｂ－ｌ?■???了??■?Ｍ?１—ａ?１｜?Ｂ?Ｉ?■?■

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本文编号：2847586