GFP转染对版纳微型猪骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
【部分图文】：
转染细胞CCK-8实验结果显示：GFP转染的p BMSC生长曲线依然呈现“S”的分布特征，按照MOI为50的剂量转染的p BMSC在传代接种后第3到5 d时增殖能力略低于对照组p BMSC，而按照MOI为100的剂量转染的p BMSC在传代接种后第2 d后增殖能力就低于对照组p BMSC，但总体趋势与对照组相似。见图2。2.3 成脂分化及其比较分析
基于病毒性载体系统构建的GFP基因转染标记是一种转染效率高、表达时间长的体内示踪技术方法，广泛应用于再生医学研究[6]。在人类免疫缺陷病毒HIV-1基础上改造构建的、携带GFP基因的慢病毒载体系统，能够将GFP基因整合到宿主分裂细胞或非分裂细胞染色体上，借助细胞扩增而表达GFP蛋白，实现干细胞示踪的目的。虽然慢病毒载体构建时已经处理了有毒的特定基因序列，但是GFP基因整合导致的基因插入突变风险依然存在。在前期研究获得了p BMSC，并从0、25、50、100、200、400这些剂量中比较确定了MOI为50是LentivirusGFP慢病毒用于p BMSC的理想剂量。发现不同属来源的干细胞GFP转染研究报道中MOI值及其GFP的标记率明显不同，使用MOI为50的慢病毒剂量，在兔骨髓间充质干细胞获得45.24%的GFP阳性率[3]，对大鼠骨髓间充质干细胞，仅用MOI为25的慢病毒剂量就获得获得97%的GFP阳性率[4]。p BMSC来源于近交系版纳微型猪，是医学研究十分难得的种子细胞。众所周知，近交衰退是动物近亲繁殖不可避免的结果,近交系版纳微型猪在培育过程中发现了许多畸形个体。因此，本研究比较关注来源于近交系的p BMSC转染GFP后的变化。结果显示：按照MOI为50的剂量加入慢病毒与p BMSC共培养6 d，可以成功标记GFP，但相同条件下p BMSC的GFP阳性率显著低于h UCMSC，表明Lentivirus-GFP慢病毒转染效率与宿主细胞的生物学特性有关。既然病毒只能依赖宿主细胞基因编码系统实现自我复制扩增，那么分裂增殖快的细胞理论上更容易获得更高的GFP阳性表达率。本研究显示：p BMSC和h UCMSC，无论哪个剂量的病毒转染，不是所有细胞都可观察到绿色荧光蛋白的表达。这可能与两种不同种属来源的细胞生物学特性及其不同增殖活性有关。猪骨髓间充质干细胞生长相对缓慢[7]，而且不同品种猪来源的骨髓间充质干细胞的分裂增殖潜能存在差异[8]，本研究相同MOI条件下p BMSC的GFP转染率低于h UCMSC可能反映了近交系版纳微型猪来源细胞对携带GFP基因的慢病毒易感性较低。本研究显示：GFP转染的p BMSC生长曲线依然呈现“S”的分布特征，按照MOI为100的剂量转染的p BMSC生长曲线虽然总体变化趋势与未转染的对照组相似，但确有不同，而按照MOI为50的剂量转染的p BMSC生长曲线几乎与未转染的对照组重叠，只是在传代接种后第3到5 d区间不同，表明慢病毒转染GFP的表达，一定程度上还是影响p BMSC的增殖活性，这与慢病毒介导GFP转染兔骨髓间充质干细胞的研究结果类似[3]，而脂质体介导GFP转染猪骨髓间充质干细胞的研究则显示GFP转染可以改变细胞周期的比例，显著抑制细胞增殖[5]。同样是慢病毒介导GFP转染兔骨髓间充质干细胞，同样是共培养24 h,MOI为50[3]和MOI为150[9]都能成功，提示筛选确定慢病毒最佳使用剂量对于特定宿主细胞而言很有必要，毕竟对细胞而言慢病毒就是异物，加入太多，至少影响了局部环境，可能干扰了细胞的生长和代谢。现有研究只是显示高剂量慢病毒转染间充质干细胞有一定毒性，最佳剂量慢病毒转染GFP的间充质干细胞仍然可以诱导分化形成脂滴[5]。本研究首次诱导分化定量分析实验显示：本研究4个组细胞脂滴吸光度值之间比较均没有显著差异，表明不同剂量慢病毒转染对p BMSC成脂分化效率没有显著影响，不同细胞GFP表达率的高低也不显著影响干细胞成脂分化。结合不是所有细胞都可观察到GFP表达的现象，暗示GFP转染效率还有提升的空间。比如，浓缩慢病毒就可以提高GFP的转染效率[10]。GFP转基因标记种子细胞用于体内示踪[11]和组织器官重建[12]是再生医学研究的重要发展方向，GFP转基因标记技术值得进一步深入研究。图2 成脂分化形态观察及比较
图1 不同剂量慢病毒共培养后细胞的形态和阳性率比较分离培养p BMSC并进行GFP基因转染标记，目的是以近交系版纳微型猪为实验动物开展后续体内实验研究。本研究结果提示：只要筛选确定了慢病毒使用最佳剂量，GFP的转染不会影响p BMSC成脂分化的生物学特性，与h UCMSC等种属来源细胞一样，来自于近交系版纳微型猪的p BMSC也不例外，慢病毒转染标记GFP可以用于体内示踪实验研究。
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