FGL2在红内期疟原虫发育中的作用和机制研究

发布时间：2020-10-22 11:38

【摘要】：疟疾依然是世界上对人类生命健康最具威胁的传染病之一。由于红内期是引起疟疾患者发病和死亡的关键时期,所以红内期疟原虫的增殖和发育机制一直是研究的重点和热点。已知红内期原虫在增殖过程中能被宿主免疫系统识别,机体内包括免疫细胞、细胞因子和抗体等在内的多种免疫效应分子在抗红内期疟原虫感染均发挥了十分重要的作用。然而,红内期疟原虫在与宿主长期共同进化的历史中,也发育出了一系列精密而完善的免疫逃避和免疫抑制机制。一方面,它可通过隐藏、伪装、变异和粘附等方式规避宿主免疫系统的攻击,另一方面,它也善于利用宿主体内多种维持机体免疫动态平衡的负向调控分子来抑制宿主的免疫应答。比如在表达于T细胞、B细胞及NKT细胞表面的PD-1及表达于活化T细胞表面的CTLA-4,均已有文献报道在疟疾红内期感染中发挥重要作用,它们的活化将抑制或耗竭免疫效应细胞,促进疟原虫增殖和发育。纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2),又称纤维介素(Fibroleukin),最初发现于感染鼠肝炎病毒(MHV-3)的小鼠体内,包含膜蛋白型mFGL2和分泌型sFGL2。mFGL2主要在内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞上表达,具有直接激活凝血酶启动凝血的功能。sFGL2主要由活化的调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)分泌,通过与细胞表面受体FcγRIIB结合发挥免疫调节作用,包括抑制DC细胞成熟进而抑制T淋巴细胞增殖和细胞因子的分泌、以及促进B细胞凋亡。sFGL2的免疫抑制作用近年来不断在肿瘤和一些炎性疾病模型中得到了证实。然而,关于sFGL2在疟原虫感染中的作用,目前尚未见任何报道。本课题研究首先检测恶性疟和间日疟患者以及夏氏疟原虫感染小鼠血清中的sFGL2的表达水平,观察其是否在疟疾红内期感染过程中表达上调。然后,我们利用FGL2缺失小鼠进行红内期感染实验,观察FGL2缺失后红内期原虫的增殖水平有无变化,明确FGL2在红内期感染中的作用。最后,对FGL2缺失影响红内期原虫增殖的分子机制展开深入探讨。一、sFGL2在疟疾红内期感染中表达显著上调1、sFGL2在疟疾红内期感染中表达显著上调:通过检测恶性疟和间日疟患者以及夏氏疟原虫感染小鼠血清中的sFGL2的表达水平,结果发现sFGL2在恶性疟和间日疟患者血清中表达水平较流行区正常人显著提高,夏氏疟原虫感染小鼠血清中的sFGL2的表达水平也随着红内期原虫的增殖而不断提高,并与原虫曲线高度吻合。2、Treg细胞是红内期感染中表达上调的sFGL2的主要来源:首先采用FACS检测感染小鼠在感染后第2、4、6、8天脾脏CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞的频率,发现Treg细胞频率随红内期原虫的增殖而不断升高。随后我们采用磁珠分选出CD4~+CD25~+Treg细胞,以CD4~+CD25~-T细胞和CD4~-CD25~-T细胞作为对照,定量检测FGL2 mRNA在各群细胞中的表达水平,发现CD4~+CD25~+Treg细胞高表达FGL2 mRNA。最后,我们还采用anti-CD25抗体耗竭CD4~+CD25~+Treg细胞,结果显示注射anti-CD25抗体小鼠血清中sFGL2的表达水平较未注射抗体的WT小鼠显著下降。以上实验充分证明CD4~+CD25~+Treg细胞是红内期感染中表达升高的sFGL2的主要来源。二、FGL2缺失后红内期原虫增殖受到显著抑制1、FGL2~(-/-)感染小鼠体内原虫增殖受到显著抑制:为进一步明确FGL2在红内期感染过程中的作用,随后我们引进了FGL2敲除小鼠进行感染实验。结果发现,无论是夏氏疟原虫、伯氏疟原虫还是约氏疟原虫感染,FGL2缺失后都将显著抑制它们在小鼠体内的增殖,而对FGL2敲除小鼠回补重组FGL2蛋白则使现象逆转,证明FGL2在疟疾红内期感染中发挥重要作用,参与了红内期原虫的免疫逃避并促进其增殖。2、FGL2~(-/-)小鼠的凝血功能没有受到显著影响:FGL2敲除后将同时导致sFGL2和mFGL2的缺失,而mFGL2的缺失可能导致凝血功能的异常,为此,我们检测了WT和FGL2~(-/-)小鼠断尾出血时间和凝血时间,结果显示FGL2~(-/-)小鼠凝血功能并没有受到显著影响。三、FGL2缺失并未增强抗红内期感染的适应性免疫1、缺失FGL2不影响疟原虫特异性CD8~+T细胞的增殖和功能:红内期原虫感染后第4、5、6天,通过流式分析疟原虫特异性CD8~+T细胞增殖和功能,结果发现,FGL2敲除小鼠脾脏疟原虫特异性CD8~+T细胞的增殖能力与WT感染小鼠无显著差异。颗粒酶、穿孔素和IFN-γ分泌能力与WT感染小鼠相比也没有显著差异。2、缺失FGL2不影响疟原虫特异性CD4~+T细胞的增殖和功能:红内期原虫感染后第4、5、6天,通过流式分析疟原虫特异性CD4~+T细胞活化。结果显示,红内期原虫感染后第7、14、21天,FGL2敲除小鼠脾脏疟原虫特异性CD4~+T细胞的活化增殖以及IFN-γ分泌能力与WT感染小鼠相比没有显著差异。3、缺失FGL2不影响GC B细胞频率:鉴于GC B细胞在疟原虫特异性抗体分泌中的重要作用,我们检测了WT和FGL2~(-/-)两组感染小鼠脾脏GC B细胞(B220~+CD95~+GL7~+)的频率和数量,结果发现两组感染小鼠之间没有显著差异。4、缺失FGL2不影响疟原虫特异性抗体分泌:由于抗体在清除疟疾红内期疟原虫中发挥了关键作用,我们检测了WT和FGL2~(-/-)两组感染小鼠血清中疟原虫特异性抗体IgG及其亚类IgG1和IgG2a的滴度,结果也显示两组感染小鼠之间没有显著差异。四、FGL2缺失显著增强抗红内期感染的天然免疫1、FGL2缺失小鼠的IFN-γ表达水平显著升高,是抑制红内期原虫增殖的主要原因:鉴于FGL2敲除小鼠体内疟原虫的增殖受到显著抑制出现在感染后第4天,因此我们检测了两种小鼠在感染后2、4、6天血清中IFN-γ的表达情况。结果显示,感染后第6天,IFN-γ在FGL2缺失小鼠体内表达水平较WT小鼠显著提高。为了进一步证实IFN-γ在FGL2敲除小鼠抑制红内期原虫增殖中的作用,我们采用拮抗抗体中和IFN-γ,结果显示,与FGL2~(-/-)组和isotype IgG组相比,中和IFN-γ后,FGL2敲除小鼠体内疟原虫增殖能力恢复到WT感染小鼠水平,说明FGL2敲除小鼠是通过调节分泌IFN-γ发挥抗疟原虫作用的。2、NK和NKT细胞是FGL2~(-/-)实验小鼠血清中表达上调的IFN-γ的主要来源:我们检测了两种小鼠在感染后2、4、6天脾脏NK和NKT细胞分泌IFN-γ的频率及数目。结果显示,感染后第6天,FGL2~(-/-)小鼠脾脏分泌IFN-γ的NK和NKT细胞数目显著高于WT小鼠。为了进一步证实增强的NK/NKT分泌IFN-γ有助于FGL2~(-/-)小鼠抑制红内期原虫增殖,WT和FGL2~(-/-)小鼠在感染过程中用抗NK1.1抗体特异耗竭NK细胞和NKT细胞。结果发现,FGL2~(-/-)小鼠NK/NKT细胞耗竭后,原虫血症较注射对照抗体组和FGL2~(-/-)组明显增加。因此,在FGL2~(-/-)感染小鼠中显著减少的原虫虫荷是由于NK和NKT细胞分泌IFN-γ增强所致。3、缺失FGL2使感染小鼠MCP-1表达水平升高,后者是募集NK/NKT细胞增多的主要原因:我们比较了WT和FGL2~(-/-)小鼠感染后2、4、6天血清中MCP-1的表达水平,发现FGL2~(-/-)小鼠血清中MCP-1表达水平在感染后第6天较WT小鼠显著提高。为进一步验证MCP-1的重要作用,我们采用了MCP-1的拮抗抗体。结果显示,缺失MCP-1可完全阻断FGL2~(-/-)小鼠脾脏NK细胞和NKT细胞的募集。同样地,MCP-1耗竭后,FGL2~(-/-)小鼠的原虫血症也恢复到WT小鼠的水平。以上结果表明MCP-1介导的NK/NKT细胞募集在抑制FGL2~(-/-)小鼠红内期原虫增殖中发挥重要作用。4、巨噬细胞是FGL2~(-/-)小鼠血清中表达上调的MCP-1的主要来源:接下来,我们探查了FGL2~(-/-)实验小鼠血清中表达上调的MCP-1的细胞来源。已有文献证实MCP-1主要由巨噬细胞产生,因此我们比较了WT和FGL2~(-/-)感染小鼠巨噬细胞产生MCP-1的能力。结果发现,FGL2~(-/-)小鼠巨噬细胞产生MCP-1的能力明显高于WT小鼠。进一步研究发现,FGL2~(-/-)小鼠脾脏中分泌MCP-1的巨噬细胞的总数也远远高于WT小鼠。这有力地表明了生成的MCP-1对募集更多的巨噬细胞到脾脏起正反馈作用,从而促进更多的MCP-1的产生。五、FGL2缺失增强抗红内期感染的天然免疫的分子机制1、sFGL2能够直接抑制巨噬细胞产生MCP-1的能力:从FGL2缺失小鼠的实验结果可知,FGL2的存在抑制了巨噬细胞分泌MCP-1的能力,但却没有直接的实验证据表明sFGL2能够直接抑制巨噬细胞产生MCP-1。为此,我们将重组FGL2蛋白(rFGL2)加入到疟原虫裂解产物pRBC刺激的RAW264.7细胞株和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)中,通过ELISA检测MCP-1的表达,结果发现,无论是RAW264.7细胞株还是BMDM,在加入rFGL2后,均能显著抑制pRBC诱导巨噬细胞分泌MCP-1的能力,证明sFGL2能够直接作用于巨噬细胞抑制其产生MCP-1。2、sFGL2通过FcγRIIB受体抑制巨噬细胞产生MCP-1的能力:已知表达于多种免疫细胞表面的FcγRIIB是sFGL2的作用受体,而巨噬细胞表面也存在FcγRIIB受体,因此我们在RAW264.7细胞株中,将FcγRIIB的拮抗抗体加入到pRBC与rFGL2共孵育的刺激孔中,结果显示sFGL2的抑制作用被废除,抗FcγRIIB抗体、pRBC与rFGL2共孵育的刺激孔的MCP-1的表达水平恢复到pRBC单独刺激孔的水平,这个结果也在BMDM中得到了印证。由此证明红内期感染中表达上调的sFGL2是通过FcγRIIB受体发挥抑制作用。3、sFGL2的抑制作用在巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠的BMDM中消失,巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠红内期原虫增殖受到显著抑制:随后,我们通过构建巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠,再次验证sFGL2-FcγRIIB信号的抑制作用。通过分离巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠的BMDM,将pRBC与rFGL2共孵育,经ELISA检测发现,pRBC单独刺激孔与pRBC和rFGL2共孵育孔,两者MCP-1的表达水平不再有差异,确实了sFGL2通过结合FcγRIIB抑制巨噬细胞产生MCP-1。另外,我们还用巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠进行了夏氏疟原虫红内期感染实验,结果显示,巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠的原虫率在感染过程中显著低于WT对照小鼠,再次有力证明sFGL2通过FcγRIIB发挥抑制作用。4、sFGL2-FcγRIIB信号抑制巨噬细胞产生MCP-1的分子机制:首先我们对巨噬细胞产生MCP-1的分子机制作了调查,已知胞内的NF-κB和MAPK信号通路与MCP-1的产生有关,而MAPK信号下游又包含ERK、p38和JNK三条支路。我们通过将多种信号通路抑制剂加入到pRBC刺激的RAW264.7细胞中,结果发现,除了p38没有作用外,其他信号抑制剂的加入,均能一定程度阻断MCP-1的产生,说明NF-κB和MAPK信号通路均参与疟原虫诱导巨噬细胞产生MCP-1。接下来,我们选取了两条信号通路上游共有的信号分子TAK1以及下游不同的信号分子IκBα、MKK4/7和JNK,通过western blot检测这些信号分子在pRBC刺激以及pRBC与rFGL2共孵育情况下的活化情况,来判断sFGL2-FcγRIIB信号作用的位点及通路,然后将结果在巨噬细胞条件缺失FcγRIIB受体小鼠的BMDM中进行验证。我们首先观察了MKK4/7-JNK支路的活化情况,结果发现,sFGL2-FcγRIIB信号对MKK4/7的活化没有显著影响,但可以显著抑制JNK的活化,提示sFGL2-FcγRIIB信号可能作用于MAPK通路下游JNK支路。但是,由于时间关系,在本论文写作时,sFGL2-FcγRIIB信号是否对另一条NF-κB通路有影响,鉴定工作正在进行中而尚未完成。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R382.31
【图文】：

图 2-1 sFGL2 在疟疾红内期感染中的表达水平。A，sFGL2 在人疟中的表达水平。NC：沈阳地区正常人；EC：流行区正常人；Pf：恶性疟患者；Pv：间日疟患者。B，sFGL2 在夏氏疟原虫感染小鼠中的表达水平。***表示 p < 0.001，**表示 p < 0.01，*表示 p < 0.05。Fig.2-1 The expression level of sFGL2 in malaria bloog stage infection. A, The expression level ofsFGL2 in human malaria. NC: normal control in Shenyang area; EC: edematic area control; Pf:Plasmodium falciparum; Pv: Plasmodium vivax. B, The expression level of sFGL2 in mice infected withPlasmodium chabaudi. *** p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05.2.2.2 Treg 细胞是红内期感染中表达上调的 sFGL2 的主要来源FGL2 在机体内主要有两种存在形式，膜型 mFGL2 和分泌型 sFGL2。mFGL2 主要由内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞表达，而 sFGL2 已知可由 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞分泌，且活化的 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞是其主要来源。本研究首先采用 FACS检测感染小鼠在感染后第 2、4、6、8 天脾脏 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞的频率，结果发现 Treg 细胞频率随红内期原虫的增殖而不断升高（图 2-2A，B，C），与 sFGL2 的表

图 2-2 Treg 在红内期感染中的表达情况。A, 小鼠脾脏 Treg 细胞频率流式图。 B, 小鼠Treg 细胞频率柱状图。C，小鼠脾脏 Treg 细胞数目柱状图。D，感染后第 8 天，FGL2 mRNA达水平。E，sFGL2 在夏氏疟原虫感染小鼠中的表达水平。***表示 p < 0.001，**表示 p < 0.01，示 p < 0.05。Fig.2-2 The expression of Treg in malaria blood stage infection. A, Gating strategy oCD4+CD25+Foxp3+Treg cells. B, Frequency histogram of splenic CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in ma histogram of the number of splenic CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in mice. D, the expression leFGL2 mRNA on 8 days post infection. E, The expression level of sFGL2 in mice infectedPlasmodium chabaudi. *** p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05.23

t 检验或单因素方差分析，认定 p < 0.05 为结果具有统计学差异。3.2 结 果3.2.1 FGL2-/-感染小鼠体内原虫增殖受到显著抑制为进一步明确 FGL2 在红内期感染过程中的作用，随后我们从本校免疫学研究所引进了 FGL2 敲除小鼠进行感染实验。结果发现，从感染后第 2 天开始直到第 8 天 WT 小鼠原虫率达到顶峰，FGL2缺失小鼠体内原虫水平始终显著低于WT感染小鼠（图3-1 A），表明红内期原虫的增殖在 FGL2 缺失后受到显著抑制。另外，P.c 疟原虫感染的 WT 小鼠在 D16 和 D20 还会出现一个原虫率的小峰，而 FGL2 缺失小鼠能在短期内完全清除红内期原虫（图 3-1 B）。此外，我们还用伯氏疟原虫 ANKA-Luciferase 株和约氏疟原虫 BY265 株进行了重复验证。结果同样显示，感染期间 FGL2 缺失小鼠体内虫荷显著低于 WT 小鼠（图 3-1 C, D）。以上结果有力证明了 FGL2 在疟疾红内期感染中发挥重要作用，参与了红内期原虫的免疫逃避并促进其增殖。
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1 付雍;FGL2在红内期疟原虫发育中的作用和机制研究[D];中国人民解放军陆军军医大学;2018年

本文编号：2851544