猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究
发布时间：2020-10-23 04:35
目的:生物信息学分析和预测猪带绦虫(Taenia solium,Ts)14-3-3基因家族及其编码蛋白的序列、结构与进化特征,分析Ts14-3-3基因家族在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达差异,原核表达Ts14-3-3.3基因并制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,分析Ts14-3-3.3蛋白的组织定位情况,为该蛋白的进一步研究奠定基础。方法:1.搜索Gene DB数据库中猪带绦虫全基因组数据,利用生物信息学分析工具及各类软件包,分析和预测Ts14-3-3基因家族的基因结构及其编码蛋白质的理化特性、二级结构、亚细胞定位、三级结构和系统进化树等。2.采集流行区猪带绦虫病人成虫标本,建立囊虫病猪模型,收集猪囊尾蚴,采用实时荧光定量PCR方法检测Ts14-3-3基因家族在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的相对表达量。3.将Ts14-3-3.3基因克隆至原核表达质粒p CznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达产物,用His Link亲和层析柱进行纯化,免疫印迹法(Western blot)鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。4.将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的定位。结果:1.通过对猪带绦虫全基因组数据库搜索,共获得6个猪带绦虫Ts14-3-3基因,基因结构均由外显子和内含子组成,其编码蛋白分子质量介于26.88~29.33KD之间,蛋白结构均为二聚体形式,分别位于4个不同的进化枝上。2.荧光定量PCR结果表明,6个Ts14-3-3基因在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达,Ts14-3-3.1、Ts14-3-3.2、Ts14-3-3.3和Ts14-3-3.4在囊尾蚴阶段表达量较高,Ts14-3-3.5和Ts14-3-3.6在成虫阶段表达量较高。3.成功构建猪带绦虫重组表达质粒p CznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 KD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。4.用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了高效价的Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论:1.初步获得了猪带绦虫Ts14-3-3基因家族的6个成员,其编码蛋白包含典型的14-3-3蛋白结构域,具有较高的序列保守性。2.猪带绦虫Ts14-3-3基因家族的6个成员在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。3.成功构建p Czn I-Ts14-3-3.3原核表达质粒,Ts14-3-3.3重组蛋白可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。4.Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.734;R383.3
【部分图文】：
遵义医科大学硕士学位论文 李想TsM_000804900、TsM_000747500 和 TsM_001162700 编码基因由 3 个外显子和 2个内含子组成，TsM_000719200 和 TsM_000569000 编码基因由 4 个外显子和 3个内含子组成（见图 1）。表 2 猪带绦虫 Ts14-3-3 蛋白结构域分析Table 2 Domain analysis of Ts14-3-3 protein of Taenia soliumDomain Start End E-value IsoformsTsM_000719200 14-3-3 7 246 5.93e-150-TsM_000804900 14-3-3 18 256 6.3e-113Zeta; DeltaTsM_000747500 14-3-3 16 248 1.43e-111Beta; AlphaTsM_000569000 14-3-3 7 249 4.24e-137EpsilonTsM_001162700 14-3-3 9 239 2.95e-31GammaTsM_000260000 14-3-3 4 255 7.26e-63-
图 2 猪带绦虫 Ts14-3-3 蛋白三级结构Fig 2 Three-dimensional structure of Ts14-3-3 protein of Taenia solium3.6 Ts14-3-3 蛋白同源序列分析通过 Clustal W 软件分析 Ts14-3-3 蛋白序列，结果显示 6 个蛋白序列一致性为 53.38%，其中 TsM_000719200 与 TsM_000569000 相似性较高，为 54.45%，TsM_001162700 与 TsM_000260000 相似性仅为 19.93%。变异性较高的序列位于N-端和 C-端，变异程度最大的蛋白是 TsM_000260000，在其序列中部有 11 个氨基酸片段的插入（见图 3）。
图 2 猪带绦虫 Ts14-3-3 蛋白三级结构Fig 2 Three-dimensional structure of Ts14-3-3 protein of Taenia solium3.6 Ts14-3-3 蛋白同源序列分析通过 Clustal W 软件分析 Ts14-3-3 蛋白序列，结果显示 6 个蛋白序列一致性为 53.38%，其中 TsM_000719200 与 TsM_000569000 相似性较高，为 54.45%，TsM_001162700 与 TsM_000260000 相似性仅为 19.93%。变异性较高的序列位于N-端和 C-端，变异程度最大的蛋白是 TsM_000260000，在其序列中部有 11 个氨基酸片段的插入（见图 3）。
【相似文献】
本文编号：2852558
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.734;R383.3
【部分图文】：
遵义医科大学硕士学位论文 李想TsM_000804900、TsM_000747500 和 TsM_001162700 编码基因由 3 个外显子和 2个内含子组成，TsM_000719200 和 TsM_000569000 编码基因由 4 个外显子和 3个内含子组成（见图 1）。表 2 猪带绦虫 Ts14-3-3 蛋白结构域分析Table 2 Domain analysis of Ts14-3-3 protein of Taenia soliumDomain Start End E-value IsoformsTsM_000719200 14-3-3 7 246 5.93e-150-TsM_000804900 14-3-3 18 256 6.3e-113Zeta; DeltaTsM_000747500 14-3-3 16 248 1.43e-111Beta; AlphaTsM_000569000 14-3-3 7 249 4.24e-137EpsilonTsM_001162700 14-3-3 9 239 2.95e-31GammaTsM_000260000 14-3-3 4 255 7.26e-63-
图 2 猪带绦虫 Ts14-3-3 蛋白三级结构Fig 2 Three-dimensional structure of Ts14-3-3 protein of Taenia solium3.6 Ts14-3-3 蛋白同源序列分析通过 Clustal W 软件分析 Ts14-3-3 蛋白序列，结果显示 6 个蛋白序列一致性为 53.38%，其中 TsM_000719200 与 TsM_000569000 相似性较高，为 54.45%，TsM_001162700 与 TsM_000260000 相似性仅为 19.93%。变异性较高的序列位于N-端和 C-端，变异程度最大的蛋白是 TsM_000260000，在其序列中部有 11 个氨基酸片段的插入（见图 3）。
图 2 猪带绦虫 Ts14-3-3 蛋白三级结构Fig 2 Three-dimensional structure of Ts14-3-3 protein of Taenia solium3.6 Ts14-3-3 蛋白同源序列分析通过 Clustal W 软件分析 Ts14-3-3 蛋白序列，结果显示 6 个蛋白序列一致性为 53.38%，其中 TsM_000719200 与 TsM_000569000 相似性较高，为 54.45%，TsM_001162700 与 TsM_000260000 相似性仅为 19.93%。变异性较高的序列位于N-端和 C-端，变异程度最大的蛋白是 TsM_000260000，在其序列中部有 11 个氨基酸片段的插入（见图 3）。
【相似文献】
相关硕士学位论文 前1条
1 李想;猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究[D];遵义医科大学;2019年
本文编号：2852558
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/2852558.html
