NR1D2介导的脂噬在类鼻疽菌胞内持续性感染中的作用机制研究

发布时间：2020-10-23 11:51

　　 类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌)感染引起的一种热带医学疾病,广泛流行分布于东南亚和澳洲北部等地,我国海南、台湾、香港等地也为主要的疫源地。类鼻疽临床表现形式多样,除了引起亚临床感染、局部的脓肿外,还可导致重症肺炎和急性败血症等,死亡率高达40%。由于类鼻疽菌耐药性强,培养易等特点,早在2006年美国CDC就将其列为I类生物战剂。随着研究的深入,大量的证据表明类鼻疽可能是一种人畜共患疾病。尤其是近些年一些非疫源地也相继出现了类鼻疽病例的报道,如南非、中东等地,我国2008年在北京奥运会期间和2014年在江苏镇江分别发生过一起输入性的类鼻疽病例。再加上国际交流和合作的更加频繁,“一带一路”的建设,海南国际旅游岛的开发以及南海海洋利益维护和主权安全保障已上升至国家战略要求,因此迫切需要深入研究类鼻疽菌感染致病的机理,寻找临床治疗的新策略。类鼻疽菌作为一种胞内寄生、严重危害公共安全的细菌,其逃逸宿主免疫造成的持续性感染是其致病的关键。类鼻疽菌能够快速地侵入宿主体内各类细胞,并使感染细胞发生融合,为自身的复制和传播创造条件,这些被感染的细胞不仅是类鼻疽菌的寄居场所,还给其提供能量和营养物质。近年来,一些研究发现在病原菌感染与免疫过程中,宿主脂质代谢和病原菌相互作用,并为病原菌感染和复制提供能量。在结核杆菌感染早期宿主细胞甘油三酯释放的脂肪酸和甾醇是结核杆菌休眠期间的唯一碳源;在肝炎病毒装备和复制进程中脂质代谢是其必不可少的能量来源。近期课题组在类鼻疽菌感染肺上皮细胞A549逃逸宿主清除机制中观察到宿主细胞脂肪代谢发生明显异常变化,脂质严重蓄积。但是这种脂质代谢的异常表现与类鼻疽菌的感染有什么关系、在其逃逸免疫中发挥什么作用、对其致病有什么生物学意义等问题尚不清楚。众所周知,脂质代谢参与细胞许多重要的生命活动,为各种细胞器形成、扩展、收缩等动态改变以及细胞内质网蛋白质降解等提供所需能量。而近年来研究发现细胞内的脂质还可以通过自噬体转运至溶酶体进行分解,此过程称为脂噬作用。脂噬作为自噬的一种亚进程,被报道与多种细菌、病毒等微生物的致病和感染密切相关。李倩博士2015年在Autophagy上曾报道过类鼻疽菌感染A549细胞早期,通过诱导MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上调,进而实时、连续地抑制其靶基因ATG10表达,负性调控自噬,从而影响宿主细胞的免疫清除,促进其胞内存活。那么,脂质代谢的异常与类鼻疽菌感染引起的自噬过程受抑有什么关系呢?而类鼻疽菌是否是通过自噬作用调节脂质代谢,从而影响细菌在胞内的增殖复制,并导致持续性感染的呢,仍有待阐明。为了探究类鼻疽菌感染过程中,自噬对脂质代谢的调控作用对类鼻疽菌胞内生存的影响,我们首先建立了类鼻疽菌感染A549细胞模型,通过透射电镜、Western Blot、激光共聚焦检测了类鼻疽菌感染的A549细胞脂质代谢和自噬水平变化情况,发现类鼻疽菌感染肺上皮细胞A549后脂质严重蓄积,脂滴堆积,脂质代谢关键分解酶活性降低;同时细胞内AKT-mTOR自噬通路明显受抑。其次,我们进一步验证了自噬与脂质代谢的关系。在药物激活或抑制自噬、siRNA干扰等条件下,通过Western Blot、激光共聚焦观察A549细胞脂质代谢情况,发现激活自噬会明显促进细胞内脂质代谢;细菌胞内计数实验发现A549细胞清除胞内类鼻疽菌的能力明显增强。接着,为了找寻类鼻疽菌是如何通过自噬调控脂质代谢的线索,我们通过类鼻疽菌感染A549细胞后表达谱芯片的筛选,利用生物信息学分析软件Cluster3.0和Tree View对脂质代谢相关基因进行了聚类分析和预测,结果发现NR1D2mRNA表达明显上调。NR1D2(Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2)是孤儿核受体家族成员,具有配体激活的功能。已有文献报道NR1D2不仅能够调节参与代谢功能的基因,如脂质代谢和炎症反应相关基因,还能可以作为诱导自噬的重要信号,与自噬信号通路中关键蛋白LC3、Beclin-1等相互作用,实现对自噬的调节。因此,为了探究在类鼻疽菌感染A549细胞过程中NR1D2是否介导自噬调节了脂质代谢,我们首先利用RT-PCR和Western Blot实验分析确证在类鼻疽菌感染A549细胞后NR1D2的表达水平明显升高。其次,我们构建了NR1D2干扰质粒,发现类鼻疽菌感染宿主细胞后干扰NR1D2的表达明显减少A549细胞中脂滴的蓄积,促进宿主细胞脂质代谢和β-氧化的速率;同时我们还观察到自噬信号通路的关键分子LC3、Beclin-1也伴随NR1D2的抑制而上调。进一步,在抑制自噬水平的条件下,干扰NR1D2表达,通过共聚焦实验发现即使干扰NR1D2的表达,相比于对照组(control+DMSO)宿主细胞脂质代谢水平也无明显改变,表明在类鼻疽菌感染A549细胞进程中,NR1D2介导了自噬调节脂质代谢。考虑到宿主脂质代谢在病原感染进程中发挥重要作用,因此我们外源补充三醋酸甘油酯,促进胞内脂质代谢速率,通过细菌胞内载量计数实验表明激活宿主细胞脂质代谢速率可以增强宿主细胞对类鼻疽菌的胞内清除能力。综上所述,本课题从脂质代谢的角度探讨了类鼻疽菌与宿主的相互作用在其感染致病中的意义,其创新性主要在于首次提出了“类鼻疽菌、脂噬、持续性感染”的作用模式。本文以脂噬为切入点,初步阐明了类鼻疽菌感染宿主细胞后,诱导核受体因子NR1D2的表达上调,干扰细胞自噬,导致宿主细胞脂质蓄积,从而逃避宿主免疫清除而发生持续性感染。该研究一方面揭示了脂噬是如何在类鼻疽菌的胞内持续性感染中发挥作用的机制,另一方面也为寻找抗类鼻疽感染的新方案提供理论依据和思路借鉴。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R378
【部分图文】：

Fig 1. The changes of lipid in A549 cells infected with B. pseudomallei. Representative TEMimages of uninfected (A) or A549 cells were infected by B. pseudomallei (B-D). B. pseudomallei infected A549cells (MOI=10:1) for 6 h, 12 h and 24 h, respectively. The scale bars are indicated. (E) Image J quantification ofthe number of lipid per cell in (A-D). (F) Image J quantification of the area of lipid per cell in (A-D). *p < 0.05,**p < 0.01.4.1.2 脂质代谢成分检测不同细胞中的脂质体存在功能、外观和组成上的差异，但最主要的成分是胆固醇和甘油三酯，为了进一步证实类鼻疽菌感染后宿主细胞脂质代谢的改变情况，我们进行了多个时间点细胞脂质形态和成分检测。分别将类鼻疽菌感染A549 细胞 6 h、12 h、24 h 后的细胞样品进行共聚焦检测和 ELISA 分析，结果表明：①类鼻疽菌感染宿主细胞后，经过尼罗红直接浸染细胞可以观察到胞内脂质体数量随着感染时间的延长明显增多（图 2A 和 2B）；②类鼻疽菌感染后，宿主细胞体内脂质成分胆固醇和甘油三酯含量随着感染时间的延长明显增加（图 2C 和 2D）。

脂质成分胆固醇含量。（D）检测胞内脂质成分甘油三脂含量。es of lipid metabolism in A549 cells infected with B. pseudomalleiMOI=10:1) infected A549 cells for 6 h, 12 h and 24 h, respectively. (A)h laser confocal microscopy. Scale bars: 5 μm. (B) Quantitative analysis of t(A). (C) Detection of intracellular lipid cholesterol content. (D) Detection oftent. *p<0.05, **p<0.01.谢关键酶检测含有大量具有多种生物学功能的蛋白酶，如环氧合酶， 合 成 酶 （ Fatty acid synthase, Fasn ） 和 脂 肪 分 解 酶ride lipase, ATGL）具有至关重要的作用。为此我们通过代谢关键酶变化，发现在不同的时间点，脂肪代谢合成酶表达明显受抑（图 3）。

类鼻疽菌感染 A549 细胞后自噬通路关键蛋白结果. B. pseudomallei inhibited autophagic pathway in A549 cells. B. pseudomallei infected A54MOI = 10:1) for 6 h, 12 h and 24 h. The expression of every protein was counted. 激活自噬有利于胞内脂质代谢脂噬作为一种重要的自噬亚进程，在胞内病原菌感染进程中发挥关键作因此，为了进一步探究自噬在类鼻疽菌感染 A549 细胞脂质代谢中的作用，分别采用不同的药物预处理细胞。由于自噬体的形成依赖于多种自噬蛋白与，包括 ATG5、ATG7、ATG10 等，其中 ATG5 在自噬泡的形成中发挥重用，并参与调节 LC3 向自噬泡的聚集导致自噬的发生，因此根据实验设计，处理组分别为使用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin, 200 nM）增强自噬，抑制剂 3-MA（3-methyladenine, 10 mM）和自噬沉默剂 ATG5 siRNA（100抑制自噬，通过激光共聚焦、Western Blot 等观察类鼻疽菌感染 A549 细胞内脂质代谢情况。其中，自噬沉默剂 ATG5 siRNA 的沉默效率通过tern Blot 和 RT-PCR 来检测（图 5）。
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本文编号：2852999