tk1基因敲除Vero细胞株的建立及其在单纯疱疹病毒tk基因修复中的应用

发布时间：2020-10-23 19:41

　　 利用单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)标准株F细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建的HSV重组病毒由于存在tk基因缺陷,无法表达胸苷激酶,影响病毒潜伏/激活,故需对该基因进行修复。为此,本研究建立了tk1基因敲除的Vero细胞株(tk1-Vero),并利用该细胞株建立了次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(Hypoxanthine-aminopurine-thymidine,HAT)选择性培养液筛选方法,对经同源重组方式完成tk基因修复的病毒进行筛选。首先,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Vero细胞tk1基因,通过有限稀释法建立tk1-Vero细胞株,采用DNA测序和Western Blot对tk1-Vero细胞株进行鉴定;比较HSV(F)和tk-HSV(F)在tk1-Vero细胞和tk基因缺陷的人骨肉瘤143细胞中的增殖情况;在tk1-Vero细胞中,采用HAT选择性培养液筛选方法,对tk基因修复病毒进行筛选。结果显示,本研究成功建立了稳定的tk1-Vero细胞株;与143细胞相比,tk1-Vero细胞更适于病毒增殖及tk基因修复病毒的筛选;最后在tk1-Vero细胞中,利用HAT选择性培养液成功筛选出tk基因修复病毒。本研究表明,采用tk1-Vero细胞株建立的HAT选择性培养液筛选方法可以对tk基因修复病毒进行高效快速筛选。
【部分图文】：

对经p Cas-Guide质粒转染及BUd R定向筛选后的tk1-Vero细胞进行DNA测序，结果显示，本研究设计的2条针对tk1基因外显子的靶向序列：5"-GGCTCTCCCAGCAAGACCCG-3"和5"-GGAGAGCCGGGCAGCACGGT-3"，均成功引导了Cas9对靶位点的剪切（图1A、1B）。利用有限稀释法建立tk1-Vero细胞株后，对该细胞株再次进行DNA测序，确认了tk1基因的稳定敲除（图1C）。2 Western Blot鉴定tk1-Vero细胞株

Western Blot结果显示，与亲本Vero细胞对比，未见tk1-Vero细胞表达相应胸苷激酶。3感染后48h tk+HSV(F）与tk-HSV(F）分别在tk1-Vero细胞与143细胞中空斑形成数

HSV潜伏/激活受多种病毒基因及宿主细胞基因调控，我们往往通过敲除病毒某个自身基因，或将宿主基因插入病毒基因组研究其调控机制，然后观察重组病毒潜伏/激活水平的变化，从而了解目的基因对病毒潜伏/激活的影响，并进一步研究其分子机制，因此实验中经常需要构建重组病毒。图4 Western Blot鉴定tk基因修复后胸苷激酶的表达
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本文编号：2853461