利用杆状病毒表达系统组装H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的研究

发布时间：2020-10-25 18:01

　　 2013年,我国华东地区出现了新型H7N9禽流感病毒疫情。截止到2017年,我国累计报告人感染H7N9禽流感病例共1398例,死亡约500人,病例覆盖我国20多个省市地区。尽管国家采取了一系列的疾病防控措施,但是H7N9禽流感病毒致人发病的病例至今仍有散在发生。面对如此严峻的形势,对于安全且高效的新型禽流感疫苗的研制开发,成为H7N9亚型禽流感防控的关键。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一种新型的基因工程疫苗,它具有安全性高、免疫效果好以及不易失活等优点,使其在病毒疫苗开发中具有重要的研究意义。目前全世界已有大量关于VLPs的研究报道,其中人类乳头瘤病毒样颗粒(HPV VLPs)疫苗已经成功上市,预示着病毒样颗粒疫苗具有广阔的市场前景。禽流感病毒样颗粒疫苗不含病毒核酸,使用时没有生物安全风险,而且可以诱导细胞免疫并对同型的异源病毒提供免疫保护,是目前最有希望替代现有禽流感疫苗的候选疫苗。因此,禽流感病毒样颗粒疫苗的研制具有极为重要的科学价值和社会效益。本研究首先对我国H7N9亚型禽流感病毒流行状况进行广泛流行病学调查,然后在此基础上筛选出流行毒株作为疫苗用毒株,将其主要结构蛋白HA基因、NA基因和M1基因进行密码子优化和全基因合成作为抗原基因,然后将HA基因和M1基因通过常规酶切克隆方法连接到pYBDM-IM转移载体中,将NA基因通过常规酶切克隆方法连接到pUCDM-XIGP转移载体中,将得到的重组转移载体通过酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳发现特异性目的条带,说明重组转移载体已经构建成功,并将其测序进一步验证抗原基因是否正确。将验证正确的两种转移载体pYBDM-IM-HA-M1和pUCDM-XIGP-NA,通过转座和位点特异性重组的方法同时重组到SW106Am/asd~-/InvC~+感受态细胞中,采取抗性筛选、蓝白斑筛选和菌液PCR等方法筛选阳性重组菌液,将得到的阳性重组菌液命名为Am-HA-NA-M1-IM-XIGP。将重组菌液采用本实验室建立的细菌感染方法直接感染Sf9昆虫细胞,收获重组病毒BV-HA-NA-M1-IM-XIGP,因为重组病毒同时携带GFP和mCherry两种报告基因,因此在荧光显微镜下可以同时观察到红色荧光和绿色荧光。收集病毒感染的Sf9细胞上清提取病毒基因组DNA,并利用设计的特异性引物进行检测,结果表明基因组DNA均PCR扩增出特异性目的条带,这说明HA基因、NA基因和M1基因已经成功重组至杆状病毒基因组中;另外,收集病毒感染的Sf9细胞沉淀进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定,用三种目的基因各自携带标签的特异性抗体检测HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白的表达情况,结果发现63KD、53KD和29KD的蛋白条带,说明H7N9亚型禽流感的HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白在Sf9昆虫细胞中成功得到表达。将重组病毒大量感染Sf9昆虫细胞,5天后收集病毒感染细胞进行蛋白质纯化,然后将纯化的蛋白质置于透射电子显微镜下进行观察,结果发现直径大小为80~120nm的病毒样颗粒结构。这说明,M1、NA和HA蛋白在Sf9昆虫细胞中得到了很好地表达,并且组装成了VLPs结构。这进一步说明了,本研究成功利用杆状病毒表达系统生产了H7N9亚型禽流感病毒样颗粒,为以后生产和制备H7N9亚型禽流感疫苗提供了技术支撑。
【学位单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373.13;S852.65
【部分图文】：

亚型禽流感病毒概述感病毒的流行与分类病毒一般只感染禽类或其它动物，禽流感就是由于动物感染禽流感一类普遍流行的传染性疾病。如果禽流感传染到人群中，最初可能感冒现象，如咳嗽、发热等症状，病情较重则可以产生肺炎，当病死亡[7]。H7N9 亚型禽流感病毒是于 2013 年春季在我国的上海、安现的，在此之前我国的法定报告传染病监测报告系统中并未包含该发现的流感病毒，是我国乃至全世界首例，而本次疫情发生后的次应疫苗予以应对，说明此次疫情较为紧急，应对难度较大。根据相该病毒主要由于亚洲东部以及我国东部和东南沿海地区禽类基因重13 年 3 月至 5 月末所发生的禽流感疫情导致 131 人感染，其中 37 人病情因得到及时有效的救治而得以生还[9]。H7N9 亚型禽流感病毒结

一种是棒状存在的血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）所组成[26]；另外一种是蘑菇状存在的神经氨酸酶蛋白（neuromin同源的四聚体所组成（图 1-2）[26]。其中血凝素（HA）和神经氨酸酶（流感病毒的 2 种重要抗原，在甲型禽流感病毒中 HA 具有 16 种亚），而 NA 具有 9 种亚型抗原（N1~N9）[26-30]。甲型禽流感病毒中 2组合，就可以构成不同种类类型的血清型甲型流感病毒，从而也决主的影响以及毒力大小能力的不同[26]。因此在世界卫生组织（WH离的流感病毒株中，对于完整的病毒命名规则规定应包括：型别/略）/分离地点/序号/分离年代，最后则需在括号中标明出 H，N 亚：2009 年，美国加利福尼亚州所分离得到的新型人感染的甲型 H1N株命名为 A/California/04/2009（H1N1）[26]。

利用杆状病毒表达系统组装 H7N9 亚型禽流感病毒样颗粒的研究液转移至离心管内，1000~1500 rpm 离心 3 min；，加入约 2 mL 培养液，吹打至均匀，滴加 2~3 滴至已加入新置于培养箱中培养。移载体的构建以及其克隆多个基因方法载体图谱如下（参考图 2-1，2-2）：其中 pYBDM 质粒为第一CDM 质粒为第二种方式供体载体。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张树梅;黄海碧;颜丕熙;滕巧泱;闫丽萍;徐大伟;呼和巴特尔;李泽君;;影响A型流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究[J];中国农业科学;2011年13期

2 Yoko M,石伟光;Ⅰ型人类免疫缺陷病毒Gag病毒样颗粒的体外组装[J];国外医学.病毒学分册;2001年01期

3 李晓眠;任中原;訾自强;周虹;;小圆形病毒样因子引起新生儿急性胃肠炎的研究[J];病毒学杂志;1989年03期

4 李天芝;于新友;;鸡病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展[J];养禽与禽病防治;2017年08期

5 吴忆春;;猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒疫苗研究进展[J];动物医学进展;2018年09期

6 许丹;郑瑾;孙丽娜;耿宜萍;李旭;王一理;;HIV-1病毒样颗粒真核表达系统的建立[J];西北大学学报(自然科学版);2008年01期

7 沈明山,苏文金,罗文新;存在于牡蛎肝胰腺的病毒样颗粒的发现[J];厦门大学学报(自然科学版);2000年04期

8 谭波;袁芳;;猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的构建[J];中国畜牧兽医文摘;2016年06期

9 司菡;曲新勇;陆家海;;病毒样颗粒疫苗的研究进展[J];中国人兽共患病学报;2008年01期

10 王亚君;华育平;;病毒样颗粒疫苗的研究进展[J];中国畜牧兽医文摘;2008年05期

相关博士学位论文 前10条

1 卢楠;利用Multibac杆状病毒表达系统生产EV71病毒样颗粒研究[D];武汉大学;2013年

2 朱诗应;丙型肝炎病毒结构基因的表达及其病毒样颗粒研究[D];第二军医大学;2005年

3 王丽娜;HPV58型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆表达及病毒样颗粒的装配与免疫学分析[D];吉林大学;2005年

4 王淼;人乳头瘤病毒6型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆、表达及病毒样颗粒的装配与免疫学分析[D];中国协和医科大学;2002年

5 张富泉;用杆状病毒表达系统构建携带日本脑炎病毒囊膜糖蛋白的逆转录病毒样颗粒[D];第四军医大学;1997年

6 赵东海;HIV-1病毒样颗粒疫苗临床前期的实验研究[D];吉林大学;2007年

7 范国成;水稻瘤矮病毒病毒样颗粒组装及Pns12蛋白的亚细胞定位[D];福建农林大学;2008年

8 邱志华;病毒样颗粒构建和治疗性降压疫苗的研究[D];华中科技大学;2013年

9 齐瑛琳;狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价[D];吉林大学;2015年

10 王淼;自组装IBDV病毒样颗粒的研制及应用[D];中国农业科学院;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 王萍;嵌合型轮状病毒与肠道病毒71型病毒样颗粒在杆状病毒表达系统中的表达与组装[D];南阳师范学院;2019年

2 宋金奇;利用杆状病毒表达系统组装H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的研究[D];南阳师范学院;2019年

3 宋品;猪细小病毒病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究[D];四川农业大学;2017年

4 蒋婕;基于病毒样颗粒的戊型肝炎病毒中和抗体8C11的作用机制和结构基础研究[D];厦门大学;2017年

5 朱毅斌;重组病毒样颗粒关键表位完整性定量分析及其在疫苗质量分析中的应用[D];厦门大学;2014年

6 曹璐;高危型HPV(HPV16/18/52/58)重组病毒样颗粒疫苗抗原活性分析方法的建立及初步应用[D];厦门大学;2017年

7 王俊;标记型PRRSV病毒样颗粒的制备与鉴定[D];中国农业科学院;2018年

8 范明惠;IBDV强、弱毒株病毒样颗粒免疫原性的比较及噬菌体抗IBDV抗体文库的构建[D];中国农业科学院;2018年

9 魏冉;H9N2亚型禽流感病毒样颗粒的构建与鉴定[D];山东农业大学;2017年

10 苗配思;猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的初步探索[D];华南农业大学;2016年

本文编号：2855767