MG胸腺微环境对S1P1阳性胸腺细胞迁出的影响及调控机理

发布时间：2020-10-27 00:30

　　 背景与目的胸腺是T细胞分化成熟的中枢免疫器官,骨髓来源的淋巴细胞共同前体经血管和淋巴管进入胸腺,在胸腺分化成熟的T细胞再经血管、淋巴管输出到达外周免疫器官定居。血管和淋巴管是细胞迁入、迁出胸腺的必由之路,血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞在该过程中发挥关键作用。IFN-γ是具有多种生物学功能的细胞因子,对内皮细胞MHC分子和黏附分子的表达具有调节作用。另一方面,胸腺细胞从胸腺输出还与细胞分化成熟状态及CD62L、1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)的表达高度相关。表达S1P1的胸腺细胞受1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)的趋化而发生迁移。S1P主要由红细胞产生,在血液和淋巴液中的浓度高于淋巴器官,这种S1P浓度梯度是细胞迁出淋巴器官所必须的。近来还发现S1P裂解酶(S1P lyase,SPL)在胸腺基质细胞、胸腺髓质PVS区、血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞上表达,可催化S1P不可逆性降解,从而保持胸腺内S1P浓度在较低水平,是成熟胸腺细胞迁出胸腺的重要保证。重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是器官特异性自身免疫性疾病,许多文献已报道MG患者胸腺及外周T细胞亚群比例异常,且在胸腺内形成针对AChR抗原特异性的Tfh和B细胞构成的生发中心,同时,MG患者胸腺中多种趋化因子异常高表达,提示MG患者胸腺和外周之间存在异常的淋巴细胞迁出或迁入。本课题组前期研究发现MG患者胸腺微环境中多种细胞因子表达异常,其中IL-6、TGFβ1、IFN-γmRNA表达与对照组胸腺相比明显增加。同时这些MG患者胸腺中S1P1~+、CD62L~+胸腺细胞增多,而且这些细胞大多聚集在脉管内或其周围,提示MG患者可能存在胸腺细胞输出异常。为探讨MG胸腺细胞异常输出与胸腺微环境中异常高表达的细胞因子IL-6、TGFβ1、IFN-γ之间的关系,本研究首先采用免疫组化和免疫荧光对MG胸腺组织中S1P1、CD62L、CD31、LYVE1的表达量和分布进行分析,其中S1P1、CD62L为介导胸腺细胞迁出的关键分子,CD31为内皮细胞的标志分子、LYVE1为淋巴管内皮细胞的标志性分子,然后采用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及人胸腺淋巴管内皮细胞(Human lymphatic endothelial cell,HLEC)培养,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western Blot检测IL-6/TGFβ1/IFN-γ对HUVEC和HLEC黏附分子、趋化因子及SPL等表达的影响,分析MG胸腺微环境对血管及淋巴管内皮细胞介导胸腺细胞迁出的调控机理,为进一步研究MG胸腺异常的机制和提高诊疗水平提供科学依据。方法(1)研究对象:试验组为临床确诊的MG患者,AChRAb阳性,行胸腺切除术治疗,胸腺病理分型为非胸腺瘤,有典型滤泡增生;对照组为非MG心脏手术患者。(2)MG胸腺细胞迁出相关分子的表达:取MG患者和对照组胸腺,进行石蜡包埋、制作组织切片,采用免疫组化、免疫荧光染色对胸腺组织中S1P1、CD62L、CD31、LYVE1的表达、分布及其相关性进行分析。免疫组化检测胸腺组织中ICAM-1、VCAM-1、SPL的表达与分布。免疫组化定量分析:应用ImageJ软件对胸腺组织石蜡切片免疫组化结果进行定量分析,采用累积光密度值(IOD)来表示组化结果的阳性程度。(3)IL6/TGFβ1/IFN-γ对HUVEC生物学特性的影响:体外培养HUVEC,IL6/TGFβ1/IFN-γ刺激HUVEC后RT-qPCR检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5、CCL19、CCL21 mRNA表达水平的变化;Western Blot检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平的变化。(4)IL6/TGFβ1/IFN-γ对HLEC生物学特性的影响:取先天性心脏病患儿胸腺,流式分选HLEC进行体外培养,IL6/TGFβ1/IFN-γ刺激HLEC后RT-qPCR检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5、CCL19、CCL21 mRNA表达水平的变化;Western Blot检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平的变化。(5)IL6/TGFβ1/IFN-γ胸腺内注射对C57BL/6小鼠胸腺组织的影响:将IL6/TGFβ1/IFN-γ分别对C57BL/6小鼠进行胸腺内注射,免疫组化检测其胸腺组织结构的变化及胸腺内ICAM-1的表达与分布。(6)统计学分析:用SPSS 21.0统计学分析软件对实验结果进行统计学分析,首先进行正态性检验,符合正态分布,采用两独立样本之间的t检验,结果采用均数±标准差表示,当P0.05时,认为差异显著,有统计学意义。实验结果(1)MG胸腺细胞迁出相关分子的表达(1)MG胸腺中S1P1、CD62L、CD31和LYVE1的表达:免疫组化及免疫荧光结果显示MG胸腺组织皮髓结构分界较不明显,髓质区域缩小。MG患者S1P1~+胸腺细胞和CD62L~+胸腺细胞增多,且多分布在脉管内和其周围。MG患者胸腺中CD31~+内皮细胞和LYVE1~+淋巴管内皮细胞增多,在皮质、髓质均有分布。(2)MG胸腺中ICAM-1、VCAM-1和SPL的表达:MG患者胸腺组织中ICAM-1~+细胞、VCAM-1~+细胞及SPL~+细胞数量均增多,ICAM-1~+细胞和SPL~+细胞大多分布在髓质区,VCAM-1~+细胞多分布在小叶间。综上所述,提示MG患者胸腺细胞输出增多。(2)IL6/TGFβ1/IFN-γ对HUVEC生物学特性的影响(1)HUVEC表达粘附分子、趋化因子和SPL mRNA水平的变化:IFN-γ刺激HUVEC后引起ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5 mRNA水平显著增高(P0.05),VCAM-1 mRNA水平早期降低,72 h表达增加,CCL19、CCL21mRNA水平降低(P0.05);IL6刺激HUVEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL mRNA水平增高(P0.05),HLA-A、HLA-DR mRNA水平无显著变化(P0.05),CCL21mRNA水平早期降低,随后增高,CCL5、CCL19 mRNA水平降低(P0.05);TGFβ1刺激组ICAM-1、SPL mRNA表达水平早期增高(P0.05),VCAM-1 mRNA水平一过性增高,72 h HLA-A mRNA水平降低(P0.05),24 h HLA-DR mRNA水平降低(P0.05),CCL5、CCL19、CCL21 mRNA水平显著降低(P0.05)。(2)HUVEC表达ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白水平的变化:IFN-γ刺激HUVEC后ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平增高;IL6刺激HUVEC后ICAM-1、SPL蛋白表达水平增高;TGFβ1刺激后ICAM-1、SPL蛋白表达水平增高。(3)IL6/TGFβ1/IFN-γ对HLEC生物学特性的影响(1)HLEC表达粘附分子、趋化因子和SPL mRNA水平的变化:IFN-γ刺激HLEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5 mRNA水平显著增高(P0.05),CCL19 mRNA水平早期降低,72 h升高,CCL21 mRNA水平显著降低(P0.05);IL6刺激HLEC后ICAM-1、HLA-A、CCL19、CCL21mRNA水平早期降低(P0.05),SPL mRNA表达无显著差异(P0.05),VCAM-1、HLA-DR、CCL5 mRNA水平随时间的增加而升高,72 h升高明显(P0.05);TGFβ1刺激组ICAM-1、VCAM-1、HLA-DR mRNA水平显著降低(P0.05),SPL mRNA表达无显著差异(P0.05),HLA-A、CCL5、CCL19、CCL21 mRNA水平早期降低(P0.05)。(2)HLEC表达ICAM-1、VCAM1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白水平的变化:IFN-γ刺激HLEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平增高;IL-6刺激组HLA-DR蛋白表达水平增高;TGFβ1刺激组HLA-DR蛋白表达水平降低。(4)IL6/TGFβ1/IFN-γ胸腺内注射对C57BL/6小鼠胸腺组织的影响IL6/TGFβ1/IFN-γ分别对C57BL/6小鼠进行胸腺内注射后,组化结果显示IFN-γ及IL6注射组小鼠胸腺组织皮髓结构界限不明显,髓质区域缩小。IFN-γ注射后,小鼠胸腺内ICAM-1的表达量显著增加,这些改变与MG患者胸腺有相似之处。结论MG胸腺微环境异常高表达的IFN-γ可通过增高血管和淋巴管内皮细胞SPL、黏附分子的表达,进而促进S1P1~+和CD62L~+细胞从胸腺输出。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

.1 MG 与非 MG 患者胸腺组织 S1P1 的表达与m 石蜡切片 S1P1 免疫组化染色。上图：MG 患右侧 200×，右下角 400×）；下图：非 MG 患右侧 200×，右下角 400×）。B. 组化定量统计（IOD）表示 S1P1 的表达量，*P<0.05，**P< CD62L 主要分布在脉管内或其周围，非 膜下。MG 患者胸腺中 CD62L+胸腺细胞（ MG 患者（2980983±386838）（P<0.05）非 MGMG

23注：A. 胸腺组织 3 μm 石蜡切片 CD62L 免疫组化染色。上图：MG 患者 CD62L 组化染色（放大倍数：左侧 100×，右侧 200×，右下角 400×）；下图：非 MG 患者 CD62L 组化染色（放大倍数：左侧 100×，右侧 200×，右下角 400×）。B. 组化定量统计结果，应用 ImageJ软件，以累积光密度值（IOD）表示 CD62L 的表达量，*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。

（3）MG 与非 MG 患者 CD31 在髓质区、皮质区均有表达，髓质区表达较多，MG 患者 CD31 的表达量（53262027±13863690）显著高于非 MG 患者（2611439±224818）（P<0.05），提示 MG 患者胸腺中可能存在脉管增生。（如图3.3）A
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本文编号：2857746