刚地弓形虫毒力因子ROP18与人细胞互作蛋白质组学分析及Ⅰ型ROP18结合人NMI蛋白干扰其功能的机制研究

发布时间：2020-10-27 00:52

　　 背景:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的棒状体蛋白(rhoptry protein)18(TgROP18)是弓形虫在入侵宿主细胞的过程中分泌到宿主细胞内的一个关键的毒力因子。TgROP18通常通过与其靶标宿主蛋白发生相互作用以调控宿主细胞的功能,然而,目前的研究只鉴定出了少数几个能与I型虫株ROP18(TgROP18Ⅰ)结合的宿主细胞蛋白,对于TgROP18Ⅰ与宿主蛋白相互作用的调控网络仍未阐明;且大多数的研究都只关注在TgROP18Ⅰ,对于II型虫株ROP18(TgROP18Ⅱ)在人细胞内的靶标蛋白及作用机制更是未知。TgROP18在小鼠体内的作用机制是通过靶定小鼠的免疫相关GTPase(immunity-related GTPases,IRGs)使其发生磷酸化而失活,从而阻止纳虫泡膜的破裂,保护弓形虫的寄生环境。然而在人细胞中几乎检测不到此IRGs系统,因此TgROP18在人细胞内的作用机制尚不清楚。本研究进行了 TgROP18Ⅰ及TgROPl8Ⅱ在人细胞中的相互作用蛋白质组学分析,并对TgROP18Ⅰ在人细胞内结合NMI并干扰NMI功能的作用机制进行探究。方法:运用高通量双分子荧光互补(BiFC)技术从18,414个人细胞蛋白cDNA表达库中筛选出与TgROP18Ⅰ或TgROP18Ⅱ互作的人细胞蛋白,运用荧光共振能量转移(FRET)及免疫共沉淀(Co-IP)方法对蛋白互作进行验证,并运用生物信息学的方法分析TgROP18Ⅰ或TgROP18Ⅱ在人细胞中的相互作用蛋白质组学。运用Co-IP及免疫荧光(IFA)方法验证TgROP18Ⅰ与人蛋白N-Myc互作因子(N-Myc and STAT interactor,NMI)在弓形虫感染的情况下的相互作用。运用基因定点突变技术构建转基因弓形虫株,鉴定TgROP18Ⅰ与NMI互作的必需氨基酸位点。通过对比在TgROP18Ⅰ存在或不存在的条件下,NMI在总的细胞中、细胞质组分中、细胞核组分中、及染色质GAS区域中蛋白水平的差异,评价TgROP18Ⅰ对NMI蛋白水平及NNMI核转移的影响。通过虫株增殖能力评价实验确定TgROP18Ⅰ对虫株IFN-y抵抗力的影响。结果:本研究从18,414个人蛋白cDNA表达库中,共鉴定出了492个与TgROP18Ⅰ相互作用的蛋白及141个与TgOP18Ⅱ相互作用的蛋白。生物信息学分析结果显示大部分的TgROP18Ⅰ 及TgROP18Ⅱ相互作用蛋白与宿主的免疫反应及细胞凋亡相关。其中NMI、IL20RB、IL21、及UBC通过FRET及Co-IP实验被证实为TgROP18Ⅰ的靶标蛋白。在感染CEP+TgROP18Ⅰ虫株的细胞中,NMI可特异地被TgROP18Ⅰ靶定而聚集在纳虫泡膜上。TgROP18Ⅰ的激酶活性及激酶结构域中的第439位精氨酸为TgROP18Ⅰ与NMI互作所必需,去除TgROP18Ⅰ的激酶活性或将TgROP18Ⅰ的第439位精氨酸突变为脯氨酸将破坏TgROP18Ⅰ与NMI的结合。TgROP18Ⅰ可降低细胞中NMI的蛋白水平,并影响NMI向细胞核转移及结合至GAS区域上。结论:在人细胞中,TgROP18通过与宿主蛋白互作,发挥调控宿主细胞的功能,尤其是与宿主免疫及细胞凋亡相关的蛋白网络互作,有利于弓形虫实现免疫逃避,促进其胞内寄生。弓形虫在感染过程中,TgROP18Ⅰ通过其激酶活性及激酶结构中的关键位点Arg-439结合NMI,并抑制NMI向细胞核转移及与GAS区域的结合,显著干扰NMI蛋白的定位及功能。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R382.5
【部分图文】：

（３９．０％）?ａｒｅ?ｅｎｒｉｃｈｅｄ?ｉｎ?ａ?ＰＰＩ?ｎｅｔｗｏｒｋ?ｗｉｔｈ?４４?ｅｄｇｅｓ．??此外，我们还运用ＩＰＡ数据库，对７＾ＲＯＰ１８Ｉ＆ｒｇＲＯＰ１８ｎ相互作用蛋白相??关的人细胞信号通路进行了分析（图１－７）。在４９２个ｒｇＲＯＰ１８ｉ相互作用蛋白中，??７１个（占所有ｒｇＲＯＰ１８＃互作用蛋白的１４．４％）相互作用蛋白富集在３４个不??同的信号通路上；而在１４１个ｒｇＲＯＰＷＨ相互作用蛋白中，１３个（占所有??ｒｇＲＯＰＷｉＪｇ互作用蛋白的９．２％）相互作用蛋白富集在１６个不同的信号通路上。??ＴｇＲＯＰ１８ｉ相互作用蛋白前５位被富集的信号通路分别是：ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ?ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ??ｆａｃｔｏｒ２?信号转导（ＥＩＦ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）?（ｐ＝１．２＞＜１０－４）；?ＪＡＫ１?及?ＪＡＫ３?在?ｙｃ?细胞因子??信号转导中的作用（ｒｏｌｅｏｆＪＡＫｌａｎｄＪＡＫＪｉｎｙｃｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）?（ｐ＝１．０４ｘｌ〇＿??３）；粒细胞的黏附及渗出（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ?ａｄｈｅｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｄｉａｐｅｄｅｓｉｓ）?（ｐ＝５．０１＞＜１０－３）；??Ｔｕｂｂｙ?介导的?Ｇ?蛋白信号转导（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?Ｔｕｂｂｙ?）（ｐ＝５．３７ｘｌ〇－??３）

??发生相互作用（图２－２Ｂ）。于是我们开始探索位于ｒｇＲ０Ｐ１８ｉ的ｖａｃｕｏｌｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ??ｄｏｍａｉｎ内的全部６个ｒｇＲＯＰｌＡ特有的氨基酸残基对于其与ＮＭＩ结合的重要性。??我们运用?Ｇｉｂｓｏｎ?Ａｓｓｅｍｂｌｙ?的方法［丨０７］，将?ＴｇＲ０Ｐ１８丨与?ｒｇＲ０Ｐ１８ｎ?的?ｖａｃｕｏｌｅ？??ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ?和激酶结构域进行了互换，构建了两株转基因虫株?—??ＣＥＰ＋：ＴｇＲＯＰ１８－ｄｏｍａｉｎｓｗａｐ?ｌ（ＣＥＰ＋ｒｇＲＯＰ１８－ＤＳｌ，；ＴｇＲ０Ｐ１８ｉｉ的Ｎ端＋ｒｇＲ０Ｐ１８ｉ??的激酶结构域）和?ＣＥＰ＋ｒｇＲＯＰ１８－ｄｏｍａｉｎｓｗａｐ２（ＣＥＰ＋７＾ＲＯＰ１８－ＤＳ２，?：ＴｇＲ０Ｐ１８ｉ??的Ｎ端＋ＴｇＲ０Ｐ１８ｎ的激酶结构域）。免疫荧光的结果显示，ＲＯＰ１８－ＤＳ１突变体??仍然可与ＮＭＩ结合，而ＲＯＰ１８－ＤＳ２突变体却不能与ＮＭＩ结合，说明位于??７＾０？１８１激酶结构域的多态性位点才是ＴｇＲ０Ｐ１８Ａ?ＮＭＩ结合这个表型所必需??的（图?２－２Ｃ）。??１１４??

??达量的增加而减少，呈现明显的剂量反应关系（图２－６Ｃ）。此外，我们还发现，??即使转染等量（２ｐｇ）的ｐＥＹＦＰ－ＮＭＩ表达质粒，在梯度转染了不同量（０，?０．５，??１，或２呢）的ｐＥＣＦＰ－ｒｇＲＯＰｌｈ表达质粒的情况下，ＮＭＩ的蛋白水平仍会随着??ｒｇＲＯＰ＾表达量的增加而减少（图２－６Ｄ）－为了确定７＾１？疋１８１对ＮＭＩ蛋白的??抑制效应是否是由于Ｔ＾ＲＯＰｌ＾引起ＮＭＩ蛋白的降解导致的，我们使用了蛋白??酶体抑制剂ＭＧ１３２来处理细胞（图２－６Ｅ）。结果显示在蛋白酶体被抑制的情况??下，７＾１１０？１８１对＿１的蛋白的抑制能力并没有明显改变，说明此抑制效应是不??依赖于蛋白酶体的（图２＿６Ｅ）。综上，这些数据说明ＧＲＯＰＩＡ降低细胞中ＮＭＩ??的蛋白水平，而对ＮＭＩ的基因转录没有影响。??１２２??
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本文编号：2857769