真核表达ZIKA病毒全基因组感染性克隆的建立

发布时间：2020-10-28 16:18

　　 目的构建含有ZIKA病毒全基因组的载体,在真核细胞中产生具有复制能力的ZIKA病毒。方法将ZIKA病毒全长基因组序列、CMV启动子、内含子、HDV核酶、SV40终止子序列利用PCR的方法进行拼接,应用重组技术将ZIKA全基因组序列克隆至细菌人工染色体载体pBAC11中,产生重组子pBAC-ZIKAi。将pBAC-ZIKA转染293T细胞中进行ZIKA病毒拯救,7 d将上清用0.45μm滤膜滤过后(ZIKA病毒P0代)感染Vero细胞(产生ZIKA病毒P1代),依此进行传代培养。应用荧光定量PCR、TCID_(50)、噬斑实验等技术检测ZIKA拯救病毒的复制能力、致病力与野生病毒的差别。结果含有内含子的ZIKA全基因组序列的感染性克隆转染293T细胞后产生具有复制能力的病毒,并且在第5代病毒仍稳定存在引入的G3128A鉴定标记。分别用拯救病毒与野生病毒感染Vero细胞,用荧光定量PCR检测细胞内病毒RNA,显示拯救病毒的复制能力与野生病毒无明显差别。TCID_(50)检测上清中的病毒滴度也相似。噬斑试验中比对两种病毒形成的噬斑均为大小一致、均匀的圆形,提示两者致病性一致。结论通过真核表达系统构建的全长ZIKA病毒基因组感染克隆具有复制能力,为ZIKA病毒的反向遗传学研究提供了理论基础。
【部分图文】：

流程图见图1。由广州市艾基生物技术有限公司合成CMV启动子序列,采用PCR的方法与寨卡病毒序列(1-5908 nt)融合产生寨卡病毒感染性克隆前段序列(ZF);由广州市艾基生物技术有限公司合成HDV的核酶序列和SV40polyA序列,应用PCR方法与寨卡病毒序列(5735-10807 nt)进行拼接产生寨卡病毒感染性克隆后段序列(ZR)。采用Infusion试剂盒,将片段ZF、ZR与核酸内切酶(Sfo I、Pac I)切割后质粒pBAC11进行重组,产生重组子pBAC-ZIKA。由广州市艾基生物技术有限公司合成内含子(intron)序列(来自于载体质粒pCI-neo),应用PCR方法插入寨卡病毒前段序列ZF(3128与3129nt之间)产生片段序列Zfi(将3128G突变为A,作为后续检测标记),将ZFi、ZR与同上酶切的载体pBAC11进行重组,产生重组子pBAC-ZIKAi。上述载体质粒的扩增均用DH10B细菌。

按图1流程产生的克隆pBAC-ZIKA转染293T,不能产生具有感染性的病毒。提取细胞内的RNA,进行分片段PCR部分片段无扩增(图2A),提示当质粒DNA转染细胞产生的RNA在细胞内产生了不正确的剪接。为了让细胞正确产生完整病毒RNA,在病毒基因组中引入内含子序列,产生克隆pBAC-ZIKAi并进行了G3128A突变,作为后续病毒鉴定检测的标记。转染293T细胞7 d后收集上清,检测显示产生了具有感染性的病毒, PCR扩出所有片段(图2 B),提示引入内含子序列的克隆其RNA在细胞内可以正确剪接。测序显示,第5代病毒仍然保持着G3128A突变,说明拯救病毒可稳定传代和增殖(图3)。2 病毒的复制能力

分别于细胞感染病毒12、24、48 h后应用荧光定量PCR技术检测细胞内病毒RNA的含量,结果显示拯救病毒的RNA可在Vero细胞中扩增,与野生病毒的RNA扩增速度相似(图4 A);将收集培养上清进行TCID50试验,两种病毒滴度也相似(图4B)。结果表明拯救病毒与野生病毒在复制能力上相似。3 病毒的致病性
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