差速离心法联合聚乙二醇6000富集脂肪间充质干细胞来源的外泌体
发布时间：2020-10-28 17:58
目的探讨通过聚乙醇6000(PEG 6000)富集分离外泌体,优化改善外泌体的分离产量。方法使用不同浓度PEG 6000分离外泌体,通过Western blot检测CD63的蛋白表达情况,筛选出最适浓度的PEG6000。以差速离心法分离出的外泌体为对照组,以最适浓度PEG 6000分离出的外泌体为实验组,比较两者之间的外泌体粒径、数量,蛋白水平(CANX、CD81、TSG101)的表达情况和miRNA(miR-133b和miR-124-3p)的表达情况。结果使用不同浓度PEG6000分离外泌体,12%PEG6000分离出的外泌体产量最多,最终筛选最适PEG6000浓度为12%完成后续实验。12%PEG 6000分离的外泌体和差速离心法分离出的外泌体作比较,前者的外泌体产量为1.35×10~8个/ml培养基,后者的外泌体的产量为6.8×10~7个/ml培养基。从蛋白水平(CANX、CD81、TSG101)的表达情况来看,同体积上样量和同蛋白上样量,PEG 6000分离的外泌体的蛋白表达水平远高于差速离心法分离出的外泌体。从miRNA(miR-133b和miR-124-3p)的表达情况来看,PEG6000分离的外泌体的miR-133b和miR-124-3p表达水平远高于差速离心法分离出的外泌体。PEG6000分离出的外泌体并不会影响成纤维细胞对其进行摄取,而且PEG6000分离出的外泌体的产量远比差速离心分离出的外泌体的产量多。结论 12%PEG6000分离出的外泌体的产量优于差速离心法分离出的外泌体,且不影响外泌体的稳定性。
【部分图文】：
将使用12%PEG 6000分离200 ml培养基所获得的外泌体和超速离心分离350 ml培养基所获得的外泌体进行蛋白标志物鉴定、电镜分析、NTA检测（图3）。按照同体积和同蛋白量上样进行CANX、TSG101和CD81鉴定。其中，无论是同体积还是同蛋白做Western blot鉴定，PEG 6000分离出的外泌体的目的蛋白量都远大于差速离心法分离出的外泌体的量。电镜结果显示差速离心（图3E）和PEG沉淀（图3F）所得外泌体均为茶托样的双层膜结构。NTA结果显示，PEG 6000分离出的外泌体的浓度为1.35×108个/ml，差速离心分离出的外泌体的浓度为6.8×107个/ml;PEG 6000分离出的外泌体粒径大小为（126.6±2.09)nm，差速离心分离出的外泌体的粒径大小为（137.8±3.8)nm。实验结果表明，12%PEG 6000分离出的外泌体产量比差速离心分离出的产量高得多，且PEG并不影响外泌体的粒径大小。图2 h Ad MSCs成脂、成骨、成软骨分化潜能鉴定（A：正常h Ad MSCs细胞形态；B：油红O染色；C：茜素红S染色；D：阿利新蓝染色；标尺：100μm)
图1 h Ad MSCs表面标志性抗原流式鉴定结果（A：总细胞散点分布；B：阴性对照；C～E:CD73+、CD90+、CD105+细胞比例）2.4 PEG 6000和差速离心分离出的外泌体的mi RNA的表达情况
在此次研究中，使用12%PEG 6000分离P3代h Ad MSC产生的外泌体。该方法分离出的外泌体与金标准差速离心法分离出的外泌体高度相似，且产量远胜于差速离心法。h Ad MSC来源的外泌体表达四跨膜蛋白超家族的CD63和CD81以及肿瘤易感基因TSG101，不表达内质网来源蛋白，如钙连接蛋白（calnexin,CANX)[23]。使用不同浓度的PEG 6000进行h Ad MSC来源的外泌体分离，可以发现，12%和16%浓度的PEG所分离出来的外泌体CD63表达量最多。但是，考虑到PEG的非降解性和免疫原性[24-25]，后续实验使用12%PEG 6000进行分离外泌体。通过Western blot可以发现，不管是同体积上样还是同蛋白量上样，PEG 6000分离出的外泌体CD81和TSG101的蛋白表达量都高于差速离心法，且两种方法分离出的外泌体都不表达CANX。从粒径大小和浓度来看，PEG 6000捕获的囊泡数量更多；从mi RNA水平和成纤维细胞摄取外泌体的情况来看，PEG 6000并不影响外泌体的mi RNA的表达水平以及成纤维细胞摄取外泌体的能力，相反效果更好。
【相似文献】
本文编号：2860418
【部分图文】：
将使用12%PEG 6000分离200 ml培养基所获得的外泌体和超速离心分离350 ml培养基所获得的外泌体进行蛋白标志物鉴定、电镜分析、NTA检测（图3）。按照同体积和同蛋白量上样进行CANX、TSG101和CD81鉴定。其中，无论是同体积还是同蛋白做Western blot鉴定，PEG 6000分离出的外泌体的目的蛋白量都远大于差速离心法分离出的外泌体的量。电镜结果显示差速离心（图3E）和PEG沉淀（图3F）所得外泌体均为茶托样的双层膜结构。NTA结果显示，PEG 6000分离出的外泌体的浓度为1.35×108个/ml，差速离心分离出的外泌体的浓度为6.8×107个/ml;PEG 6000分离出的外泌体粒径大小为（126.6±2.09)nm，差速离心分离出的外泌体的粒径大小为（137.8±3.8)nm。实验结果表明，12%PEG 6000分离出的外泌体产量比差速离心分离出的产量高得多，且PEG并不影响外泌体的粒径大小。图2 h Ad MSCs成脂、成骨、成软骨分化潜能鉴定（A：正常h Ad MSCs细胞形态；B：油红O染色；C：茜素红S染色；D：阿利新蓝染色；标尺：100μm)
图1 h Ad MSCs表面标志性抗原流式鉴定结果（A：总细胞散点分布；B：阴性对照；C～E:CD73+、CD90+、CD105+细胞比例）2.4 PEG 6000和差速离心分离出的外泌体的mi RNA的表达情况
在此次研究中，使用12%PEG 6000分离P3代h Ad MSC产生的外泌体。该方法分离出的外泌体与金标准差速离心法分离出的外泌体高度相似，且产量远胜于差速离心法。h Ad MSC来源的外泌体表达四跨膜蛋白超家族的CD63和CD81以及肿瘤易感基因TSG101，不表达内质网来源蛋白，如钙连接蛋白（calnexin,CANX)[23]。使用不同浓度的PEG 6000进行h Ad MSC来源的外泌体分离，可以发现，12%和16%浓度的PEG所分离出来的外泌体CD63表达量最多。但是，考虑到PEG的非降解性和免疫原性[24-25]，后续实验使用12%PEG 6000进行分离外泌体。通过Western blot可以发现，不管是同体积上样还是同蛋白量上样，PEG 6000分离出的外泌体CD81和TSG101的蛋白表达量都高于差速离心法，且两种方法分离出的外泌体都不表达CANX。从粒径大小和浓度来看，PEG 6000捕获的囊泡数量更多；从mi RNA水平和成纤维细胞摄取外泌体的情况来看，PEG 6000并不影响外泌体的mi RNA的表达水平以及成纤维细胞摄取外泌体的能力，相反效果更好。
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本文编号：2860418
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