富含血小板血浆对毛乳头细胞生物学的影响及用于毛囊重建的研究

发布时间：2020-10-30 02:04

　　 背景和目的构建组织工程毛囊实现毛囊再生是治疗秃发较有前景的方案。构建组织工程毛囊三大经典要素分别为:种子细胞、细胞支架和信号分子。毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)是毛囊重建重要的种子细胞。但是,在常规二维培养过程中,DPCs随着传代次数的增加而逐渐丧失其毛发诱导能力。短时间内大量获取具有诱导能力的DPCs仍比较困难。因此,改善DPCs体外培养条件,扩增细胞数量的同时维持甚至增强其诱导能力至关重要。此外,寻找一种合适的毛囊组织工程支架材料也很有必要。富含血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)经激活后可释放出大量的生长因子,可促进细胞增殖、分化,临床研究表明PRP可用于秃发的治疗,促进毛发生长。PRP凝胶结构呈渔网状,细胞在胶内可存活并增殖,是一种合适的组织工程支架材料。因此,我们在本实验中通过在培养基中添加激活的PRP改善DPCs体外培养条件,并对PRP凝胶作为细胞支架用于毛囊重建及用于DPCs三维培养的可行性进行了探讨。该研究结果,不仅为快速获取大量的具有诱导能力的DPCs提供新的方法,也为秃发的治疗提供新策略。方法1.PRP对小鼠及人来源DPCs生物学影响的研究两步离心法提取PRP,经激活后将不同浓度的激活的PRP上清液添加至培养基中培养小鼠及人DPCs,通过CCK8增殖试验筛选出最佳促DPCs增殖的PRP上清液浓度,并对最佳浓度培养条件下的DPCs进行免疫荧光、Western-blot、PCR检测PRP对DPCs生物学活性和特性的影响。通过动物体内毛囊重建模型检测DPCs诱导能力。2.PRP对人DPCs生物学影响的机制研究通过免疫荧光及Western-blot对人DPCs细胞表面磷酸化受体表达情况进行了检测,并通过人磷酸化蛋白芯片对受体所介导的信号通路进行了检测。3.PRP凝胶作为细胞支架用于毛囊重建的研究将DPCs、上皮细胞与适量的PRP混合后经凝血酶激活形成包含生发细胞的PRP凝胶,将此凝胶移植至裸鼠背部创面,观察毛囊重建的情况。4.PRP凝胶作为人DPCs三维培养支架的可行性研究将不同数量级及不同代数的人DPCs接种至PRP凝胶上进行培养,观察细胞生长状况及聚集成球情况。结果1.PRP对小鼠及人来源DPCs生物学的影响低浓度激活的PRP可促进人和鼠DPCs增殖,其中5%浓度具有最强的促DPCs增殖作用。对添加5%激活的PRP培养条件下的DPCs的生物学功能指标进行了蛋白水平及基因水平检测,发现与其诱导能力相关的标记物ALP、β-catenin及Versican较对照组均表达上调。动物实验证实添加5%激活的PRP培养的小鼠DPCs较普通培养基培养的DPCs具有更强的毛囊诱导能力。而人DPCs与新生鼠上皮细胞通过微型小室法移植并不能重建出毛囊。2.PRP对人DPCs生物学影响的机制研究添加5%激活的PRP培养条件下的DPCs细胞表面磷酸化受体FGFR1,PDGFRα及PDGFRβ蛋白表达水平明显上调。蛋白芯片结果显示人DPCs磷酸化ERK,JUK,p38及Akt信号蛋白表达水平均出现明显上调,GSK-3信号蛋白表达水平下调。3.PRP凝胶作为细胞支架用于毛囊重建的研究包含小鼠DPCs及新生鼠上皮细胞的PRP凝胶移植到裸鼠背部创面后可重建出新的毛囊,且毛发拔除后能够再生新的毛发。而包含人DPCs及人包皮上皮细胞的PRP凝胶移植到裸鼠背部创面后不能重建出新的毛囊。4.PRP凝胶作为人DPCs三维培养支架的研究人DPCs以0.5×104、1×104、2×104每孔的数量级接种至96孔板PRP凝胶上培养,细胞既不贴壁生长也不聚集成球;增大密度至5×104时,每孔仅可见数个细胞聚集体形成,且形状不规则,细胞间连接不紧密,其他绝大部分细胞均呈接种时的圆形状态;低代与高代DPCs生长方式相似。结论1.培养基中添加5%激活的PRP上清液可明显促进小鼠及人DPCs的增殖,并增强其毛囊诱导能力。2.PRP促进人DPCs增殖并增强其诱导能力是通过上调磷酸化受体FGFR1,PDGFRα及PDGFRβ的表达,从而激活MAPK、Akt及Wnt信号通路。3.PRP凝胶可作为细胞支架用于组织工程毛囊再生。4.PRP凝胶不适用于人DPCs的三维培养。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

?博士学位论文???结果??１．?ＤＰ的形态、贴壁及细胞迁出??显微镜下观察可见，使用显微解剖法结合酶消化法获得的ＤＰ形态完整，呈??半透明的卵圆形，小鼠触须ＤＰ体积较人头皮ＤＰ体积要小些（图ｌａ）。ＤＰ在接种??后２ｄ，大部分已贴壁，且部分ＤＰ周围可见少量细胞迁出，迁出的ＤＰＣｓ呈长梭??形或多边形（图ｌｂ），外观类似于真皮成纤维细胞。５ｄ后，在ＤＰ组织周围可见较??多长梭形细胞迁出，围绕ＤＰ组织呈同心圆样放射状排列（图ｌｃ）。７－８ｄ后，ＤＰ??内的细胞基本全部迁出。小鼠触须ＤＰＣｓ与人头皮ＤＰＣｓ外形及细胞迁出方式相??似，但体积小于人头皮ＤＰＣｓ。??

。，多长梭形细胞迁出，围绕ＤＰ组织呈同心圆样放射状排列（图ｌｃ）。７－８ｄ后，ＤＰ??内的细胞基本全部迁出。小鼠触须ＤＰＣｓ与人头皮ＤＰＣｓ外形及细胞迁出方式相??似，但体积小于人头皮ＤＰＣｓ。??Ｈ??图１－１．小鼠触须ＤＰＣｓ的体外原代培养及观察。ａ．显微解剖法结合酶消化法分离获得的ＤＰ．??ｂ．ＤＰ接种２ｄ后；ｃ．ＤＰ接种５ｄ后。比例尺＝５００阿。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－１．?Ｔｈｅ?ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ?ｍｉｃｅ?ｖｉｂｒｉｓｓａｅ?ｄｅｒｍａｌ?ｐａｐｉｌｌａ?ｃｅｌｌｓ?ｉｎ?ｖｉｔｒｏ．??ａ．?Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｅｒｍａｌ?ｐａｐｉｌｌａ?ａｆｔｅｒ?ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ?ｃｏｍｂｉｎｅｄ?ｗｉｔｈ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?；?ｂ．?Ａｆｔｅｒ?２??ｄａｙｓ?ｏｆ?ｃｕｌｔｕｒｅ?；?ｃ．?ａｆｔｅｒ?５?ｄａｙｓ?ｏｆ?ｃｕｌｔｕｒｅ．?Ｓｃａｌｅ?ｂａｒｓ＝５００｜ｉｍ．??

为了探讨不同浓度ａＰＲＰ对小鼠触须及人头皮ＤＰＣｓ活性的影响，我们采用??ＣＣＫ－８检测了培养不同时间的小鼠触须ＤＰＣ和人头皮ＤＰＣｓ的吸光度值，并且??将代表细胞增殖的吸光度值进行统计分析。如图２ａ所示，低浓度ａＰＲＰ可促进??小鼠触须ＤＰＣｓ增殖，５％?ａＰＲＰ具有最强的促进ＤＰＣｓ増殖的作用，在培养第５ｄ??时最明显。但是，高浓度ａＰＲＰ?（１０％和１５％）并不具有促进小鼠触须ＤＰＣｓ增??殖的作用。不同浓度ａＰＲＰ对人头皮ＤＰＣｓ活性的影响与小鼠触须ＤＰＣｓ相似，??低浓度ａＰＲＰ可促进人头皮ＤＰＣｓ增殖，５％?ａＰＲＰ具有最强的促进ＤＰＣｓ增殖的??作用，而高浓度ａＰＲＰ并不能促进人头皮ＤＰＣｓ增殖（图２ｂ）。??１５??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

本文编号：2861810