铜绿假单胞菌转录因子PA4203及PA3721结构与功能研究

发布时间：2020-10-30 11:04

　　 铜绿假单胞菌属革兰氏阴性菌,是常见的条件致病菌之一,主要感染免疫力低下的病人,能够引起烧伤后感染、肺部感染、术后伤口感染等。铜绿假单胞菌在自然界中分布非常广泛,能够适应多种环境,能够抵抗多种抗生素,因此对于铜绿假单胞菌的治疗并不理想。铜绿假单胞菌能够适应多种环境并在不同环境下引起感染与该菌含有多种转录因子以及复杂的毒力因子系统密不可分。多重耐药外排泵系统是铜绿假单胞菌产生耐药性的重要原因之一。因此研究转录因子对耐药外排泵的调控机制以及毒力因子在该机制中发挥的功能是至关重要的。近年来有研究表明,当外加铜绿假单胞菌自身分泌的毒力因子绿脓菌素时,外排泵MexGHI-OpmD相关基因以及抑制外排泵MexAB-OprM转录因子PA3721有明显的上调,因此本文通过对位于MexGHI-OpmD外排泵上游转录因子PA4203以及转录因子PA3721的研究,进一步探索绿脓菌素对于转录因子调控外排泵的影响,以及PA4203与PA3721的作用机制。本论文主要分为两部分,第一部分为PA4203结构与功能研究。PA4203属LysR家族转录因子,具有保守的N端HTH DNA结合结构域,以及可变的C-末端结构域。该家族转录因子结构保守且功能广泛,参与细胞分裂、群体感应、毒素产生等多种调节途径。本论文中,我们通过反常散射法成功地解析了转录因子PA4203分辨率为2.4 A的蛋白质结构,PA4203每个不对称单位含有四个蛋白质分子,并通过分析超离实验验证在溶液状态下以四聚体形式存在。并且发现当外加绿脓菌素时,转录因子PA4203的表达上调,验证了 PA4203不是PYO的受体蛋白,但是对于PA4203调控外排泵MexGHI-OpmD的机制尚未研究清楚。第二部分为PA3721结构与功能研究。PA3721属tetR型转录因子,能够抑制转录因子MexR的阻遏物ArmR,从而间接的抑制铜绿假单胞菌中的多药外排泵MexAB-OprM。本论文中,我们成功地解析了转录因子PA3721分辨率为2.1 A的蛋白质结构,PA3721每个不对称单位内有一个蛋白质分子。经过pisa计算及分子筛凝胶层析实验证明其在溶液状态下为二聚体状态。初步发现PYO对PA3721的DNA结合能力无明显影响。当敲除P43721基因后,菌体对于阿奇霉素、氯霉素、羧苄西林、诺氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、环丙沙星这几种抗生素的耐药性增强。综合来讲,本文主要研究了铜绿假单胞菌的两种转录因子PA4203和PA3721的结构及功能,初步验证了绿脓菌素对它们功能的影响,探究了它们在多重耐药外排泵机制中的功能。鉴于多重耐药外排泵和绿脓菌素在铜绿假单胞菌致病性以及耐药性中的重要作用,我们的课题有待进一步深入研究。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R378
【部分图文】：

图１－２五种外排泵家族结构模式图（Ｐａｕｌｓｅｎ，?２００３）??根据底物的特异性，外排泵又可以分为特异性外排泵和多重耐药性外排泵。??其中多重耐药的外排泵类型分布较为广泛，宿主广泛，外排底物种类也很广泛，??可以外排多种抗生素，对临床治疗来说是一个非常大的挑战。铜绿假单胞菌的耐??药外排泵主要属于ＲＮＤ家族，该家族外排泵主要有三个组分：内膜转运蛋白??（ＭｅｘＢ，Ｄ，Ｆ，?Ｙ，?Ｋ，丨），内膜相关质膜融合蛋白（ＭｅｘＡ，Ｃ，Ｅ，Ｘ，Ｊ，?Ｈ）以及外排??通道蛋白（ＯｐｒＭ．．?ＬＮ，?ＯｐｍＤ）。早在２００２年，ＭｕｒａｋａｍｉＳ／．ｆ人就报道了大肠??杆菌外排栗内膜转运蛋白ＡｃｒＲ的晶体结构，该蛋白为ＭｅｘＢ家族蛋白（Ｍｕｒａｋａｍｉ??ｅｔ?ａＬ?２００２）。２００４?年?Ａｋａｍａ?Ｈ?等人又解｜）「丨丨?１?／?ＭｅｘＡ?的品休结构（Ａｋａｍａ?ｅｔ?ａｌ．，??２００４），?ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ外排泵是敁苹证实的ＲＮＤ外排泵，其具有最广的底物特??异性，它的外排作用导致野生型铜绿假单胞菌对四环素类，氯霉素类，氨基糖苷??类，大环内酯类，Ｐ－内酰胺类等多种抗生素产生耐药。己经有报道证明当铜绿假??单胞菌过量表达ＭｅｘＡＢ－ｏｐｒＭ外排泵蛋白时与敲除菌株相比，左氧氟沙星的最??

图１－５绿脓菌素引起基因表达上调结果（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ?ｅｔａｌ．，２００６）??课题研究主要内容??脓菌素是铜绿假单胞菌分泌的重要的毒力因子，并且该毒力因子在铜绿耐药性中其重要的作用，能够调节多种细胞功能，因此对于绿脓菌素受研宂是非常有意义的。基于课题组对于转录因子ＢｒｌＲ的研究，发现该在表达以及结合ｐｒｏｍｏｔｅｒ区执行功能方面都受到了绿脓菌素的影响，该转录因子为绿脓菌素的受体蛋白（Ｗａｎｇ?ｅｔａｌ．，２０１８）。结合研究数据，筛选出了两个转录因子ＰＡ４２０３以及ＰＡ３７２１。??Ａ４２０３是位于耐药外排栗ＭｅｘＧＨｌ－ＯｐｍＤ上游的转录因子，当外加绿脓ＭｅｘＧＨＩ－ＯｐｍＤ外排泵相关基因有明显的上调。这种显著的转录上调是转录因子ＰＡ４２０３来调控的呢？?ＰＡ４２０３是否为绿脓菌素的受体蛋白呢？??

ＰＡ４２０３属于ＬｙｓＲ型转录因子，ＬｙｓＲ型转录调节因子（ＬＴＴＲｓ）形成一个??大而多样的调节因子家族，其具有保守的Ｎ端ＨＴＨ?ＤＮＡ结合结构域，以及可??变的Ｃ－末端结构域，该结构域通常负责与不同受体的结合（Ｍａｄｄｏｃｋｓ?＆?Ｏｙｓｔｏｎ．??２００８）。ＬｙｓＲ型转录因子的功能广泛且保守，其可以参与细胞分裂、群体感应、??毒素产生等多种调节途径（Ｃａｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００１；?Ｋｉｍ?ｅｔ?ａｌ．，２００４；?Ｌｉｉ?ｅｔ?ａｌ．．?２００７）。３－硝??基丙酸酯（３－ＮＰＡ）是由植物和真菌产生的硝基毒素（Ｆｒａｎｃｉｓ?ｅｔ?ａｌ．．?２０１２：?Ｆｒａｎｃｉｓ?ｅｔ??ａｌ．，２０１３），在生理条件下可以与其共轭碱丙酸－３－硝酸酯（Ｐ３Ｎ）平衡存在，Ｐ３Ｎ??能够抑制三羧酸（ＴＣＡ）循环酶琥珀酸脱氢酶的活性（Ｈｕａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２００６），而??ＰＡ４２０２是Ｐ３Ｎ单加氧酶，能够将其转化为丙二酸半醛进而形成乙酰辅酶Ａ。己??有研究表明ＰＡ４２０３结合ＰＡ４２０２－?ＰＡ４２０３之间１０７?ｂｐ区，并且当敲除ＰＡ４２０３??后，细菌表现出对３－ＮＰＡ敏感性增力ｎ（Ｖｅｒｃａｍｍｅｎ?ｅｔ?ａｌ．，２０１５）。与此同时，转录??因子位十耐药外排泵ＭｅｘＧＨＩ－Ｏｐｍ【）的上游，因此对于转录因子ＰＡ４２０３的研究??是非常有必要的。??３Ｈ（，??．＾??
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本文编号：2862383