两种传代方法影响人胚胎干细胞转染效率的比较

发布时间：2020-11-03 03:21

　　 背景:现有方法将外源分子如DNA导入到人胚胎干细胞用于科学研究的效率普遍较低,如何优化现有条件,提高转染效率显得尤为重要。目的:比较两种不同的传代方法对人胚胎干细胞系H9转染效率的影响,优化胚胎干细胞转染条件。方法:人胚胎干细胞系H9分别采用小克隆传代法和单细胞传代法进行传代,传代后继续培养细胞48h,用Lipofectamine 3000转染p AdTrack-AKT1荧光质粒2 d后,荧光显微镜下观察荧光质粒的表达,流式细胞仪检测人胚胎干细胞的转染效率;RT-qPCR和Westernblot分别检测转染后AKT1在mRNA和蛋白质水平的表达。结果与结论:①荧光显微镜下观察发现单细胞传代组表达荧光质粒的细胞数量更多,流式细胞仪检测单细胞传代法的转染效率[(47.18±2.00)%]高于小克隆传代法的转染效率[(19.52±0.86)%],差异有显著性意义(P0.01);②单细胞传代组转染后AKT1 mRNA和蛋白的表达均高于小克隆传代组,差异有显著性意义(P 0.01);③结果表明,采用单细胞传代法,增加细胞与转染试剂脂质体的接触面积可提高人胚胎干细胞的转染效率。
【部分图文】：

妆泶锼?剑?峁?砻鞯ハ赴???ń档拖?胞汇合度和细胞间的紧密程度可明显提高人胚胎干细胞的转染效率；同时也发现细胞密度过小，脂质体毒性作用明显，细胞死亡增多，转染效率亦不高。因此，转染前优化图注：图中A-C分别为培养第1，3，7天时的细胞形态，培养7d时细胞汇合度可达80%-90%图1无饲养层培养的人胚胎干细胞形态(×100)Figure1Cellmorphologyofhumanembryonicstemcellsonfeeder-freeplates(×100)图注：通过细胞免疫荧光检测，结果发现人胚胎干细胞均表达其特异性标志物SOX2和OCT4图2人胚胎干细胞特异性标志物的表达(×100)Figure2Expressionofspecificmolecularmarkersofhumanembryonicstemcells(×100)图注：图中A-C为小克隆传代，其中A为转染前明场下细胞形态，B为转染2d后明场下细胞形态，C为B图对应的荧光图；D-F为单细胞传代，其中D为转染前明场下细胞形态，E为转染2d后明场下细胞形态，F为E图对应的荧光图图3两种不同方法传代后的人胚胎干细胞形态及转染pAdTrack-AKT1荧光质粒后的绿色荧光蛋白表达(×100)Figure3HumanembryonicstemcellswithtwopassagemethodsandexpressionofgreenfluorescentproteinafterpAdTrack-AKT1transfection(×100)小克隆传代单细胞传代100806040200转染效率(%)P<0.01小克隆传代单细胞传代小克隆传代单细胞传代小克隆传代单细胞传代3210P<0.01P<0.01AKT1蛋白表达水平AKT1mRAN表达水平543210AKT1GAPDH图注：图中A为小克隆传代流式检测代表图；B为单细胞传代流式检测代表图；C为两组人?
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