膜联蛋白A2在登革病毒Ⅱ型入胞过程中作用的初步研究

发布时间：2020-11-03 04:38

　　 目的探讨膜联蛋白A2(annexin A2, ANXA2)在登革病毒Ⅱ型(dengue virus typeⅡ, DENV-2)入胞过程中的作用。方法通过敲低ANXA2和S100钙结合蛋白A10(S100A10)表达以及抗体阻断实验验证ANXA2在DENV-2复制周期中的作用,并进一步通过激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀分析明确ANXA2与DENV-2 E蛋白的相互作用。结果 DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的细胞中,DENV-2 RNA水平显著降低;ANXA2抗体和DENV-2 E蛋白抗体可有效抑制DENV-2的入胞效率,细胞内病毒RNA水平显著低于对照组;此外,ANXA2在DENV-2感染细胞中由细胞质募集到细胞膜上,与DENV-2 E蛋白有相互作用。结论 ANXA2是DENV-2入胞过程中重要的宿主分子,有望为抗DENV-2研究提供新的靶点。
【部分图文】：

ANXA2是一种重要的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，分子量约为38 kDa，参与细胞的多种生理生化活动，如胞膜运动、囊泡运输、胞吞和胞吐作用等。在细胞受到刺激后，ANXA2从细胞质转移到细胞膜，与S100A10形成异源四聚体[10]。本研究通过激光共聚焦显微镜观察到DENV-2吸附至Huh-7细胞的过程中，可诱导细胞质内分布的ANXA2募集到细胞膜上，并且与DENV-2 E蛋白共定位，而S100A10是否在此过程中起作用还需继续研究；免疫共沉淀实验进一步明确了DENV-2 E蛋白与ANXA2和S100A10的相互作用。在之前的研究报道中，ANXA2参与了HPV-16和巨细胞病毒的内吞过程，并且可增强病毒感染[13-14]。HPV-16在人角质形成细胞中诱导ANXA2转移到细胞膜外，从而作为受体分子结合HPV-16并介导病毒内吞；在人巨细胞病毒感染过程中，病毒与ANXA2结合并增强了人巨细胞病毒的感染[15]。此外，还有研究发现，在感染HBV后的细胞中，细胞膜上ANXA2水平逐渐下降，可有效防止HBV的过度感染[16]。另有研究观察到ANXA2在人胚横纹肌瘤细胞表面的表达增强了EV71型的感染[17]。图4 ANXA2、S100A10与DENV-2 E蛋白在细胞内的相互作用

图3 ANXA2与DENV-2 E蛋白在病毒入胞阶段的共定位分析本研究中，低表达S100A10和ANXA2的细胞中，DENV-2 RNA的复制水平降低，提示S100A10和ANXA2对DENV-2的复制周期有显著影响。抗体阻断实验中，以DENV-2 E蛋白抗体作为阳性对照、鼠IgG抗体作为阴性对照，ANXA2抗体可显著抑制进入细胞的DENV-2，表明ANXA2在DENV-2入胞阶段参与DENV-2的复制周期，是DENV-2感染起始过程中的重要宿主因子之一。因此，ANXA2在多种病毒包括DENV-2感染细胞的入胞过程中均起到重要的促进作用。除了参与病毒的入胞阶段，ANXA2在HCV致病机制中也起着重要作用，可将病毒NS3/NS4A募集到脂筏微结构域，从而在Huh7.5细胞中启动病毒复制复合物[18]。DENV-2与HCV具有相似的复制机制，ANXA2是否在DENV-2入胞后的复制阶段调控病毒的翻译和转录尚未见报道。此外，ANXA2促进DENV-2入胞是以单体形式还是与S100A10形成四聚体形式发挥功能还须深入研究。

基因敲低实验结果显示，3对针对ANXA2的shRNA中，与对照组相比，1号shRNA可抑制63.6%ANXA2 mRNA表达（t=6.222,P=0.003),2号shRNA可抑制77.8%ANXA2 mRNA表达（t=7.671,P=0.002),3号sh RNA无抑制效果（t=0.037,P=0.972）（见图1A);3对针对S100A10的shRNA中，与对照组相比，1号shRNA无抑制效果（t=2.096,P=0.104),2号sh RNA可抑制85.1%S100A10m RNA表达（t=6.382,P=0.003),3号shRNA可抑制41.4%S100A10 mRNA表达（t=2.842,P=0.047）（见图1 B);ANXA2敲低的细胞中，DENV-2 RNA水平为对照组的14.2%(t=14.860,P=0.000),S100A10敲低的细胞中，DENV-2RNA水平为对照组的44.7%(t=6.881,P=0.002）（见图1 C）。2.2 ANXA2抗体可有效阻断DENV-2感染Huh-7细胞
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