金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

发布时间：2020-11-03 15:09

　　 目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC_007795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mAT相对分子质量约为34 000,以可溶性形式表达。纯化的重组蛋白mAT可诱导小鼠产生滴度为1∶580 000的IgG抗体,且以IgG1亚型(抗体滴度为1∶440 000)为主。试验组小鼠对49521 3次攻毒的保护率分别为75.0%、70.0%和83.3%,对49525菌的保护率分别为80.0%、60.0%和80.0%,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论金葡菌无毒性重组蛋白mAT具有较好的免疫原性和免疫保护作用,可作为多抗原组分疫苗研究的候选抗原。
【部分图文】：

结果显示，在不同诱导条件下目的蛋白表达量无区别；选择终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,16℃诱导16 h为诱导表达条件，重组蛋白mAT相对分子质量约为34 000（含6×His-Tag），以可溶性形式表达。见图2。图2 重组蛋白mAT的SDS-PAGE分析

重组蛋白mAT的SDS-PAGE分析

经12%SDS-PAGE分析，纯化的目的蛋白mAT相对分子质量约为34 000，主要存在于含250和500 mmol/L咪唑的洗脱液中。见图3。2.4 血清中抗体水平
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