脐带间充质干细胞分泌因子脂质体囊泡制备及对损伤组织修复作用的研究

发布时间：2020-11-06 02:26

　　 目的:分离纯化和增殖培养脐带间充质干细胞,收集无动物源性干细胞分泌因子制备成脂质体囊泡,观察脂质体的形态与粒径分布,通过细胞学和动物实验观察其对皮肤创伤的修复作用和生物安全性,为创伤治疗提供新型干细胞基质制剂并对其作用机理和安全性进行初步的探讨和评估。方法:1.脐带组织贴壁法分离纯化和传代培养hUC-MSC,观察其形态,并对其表面标记物和成脂肪细胞、成骨细胞分化能力进行检测。2.收集无动物源性hUC-MSC分泌因子(条件培养液),通过ELISA法对收集的条件培养基进行VEGF、IL-8、MCP-1因子的定量测定。3.用薄膜分散法制备hUC-MSC因子脂质体囊泡,对其进行电镜下超微形态的观察和粒径分布特征的测定。4.通过与人原代真皮成纤维细胞共培养的方法,观察hUC-MSC分泌因子对人原代真皮成纤维细胞的胶原蛋白I表达量的影响。5.通过动物实验观察hUC-MSC条件培养液及其脂质体对大鼠皮肤缺损模型的创伤修复作用,进一步对其有效性、作用机理和安全性进行探讨和评估。结果:1.光镜下,hUC-MSC呈大小形态均一的长梭型旋涡状,流式细胞仪检测hUC-MSC阳性标志物CD29、CD44、105的表达率均≥95%,阴性标志物CD34、CD45的表达率≤5%,且hUC-MSC可被诱导分化为脂肪细胞和骨细胞。2.hUC-MSC条件培养液中含有干细胞分泌因子,在P5代时,蛋白浓度为0.145mg/m L,经考马斯亮蓝染色有蛋白条带出现,经ELISA测定,条件培养液中VEGF、IL-8、MCP-1的浓度分别为558.60 pg/m L、5236.48pg/m L、2972.55pg/m L;而空白培养基中,蛋白含量为0.002 mg/m L,因子VEGF、IL-8、MCP-1的浓度分别为0.000 pg/m L、0.000pg/m L、0.000pg/m L。3.用薄膜分散法制备得到hUC-MSC分泌因子脂质体,其粒径呈拟正态分布,粒径范围在37.84nm~3580.00nm,平均粒径为262.3nm;电镜下,hUC-MSC分泌因子脂质体呈不规则的圆球状,大小不均一,但分散比较均匀。4.通过与人原代真皮成纤维细胞共培养,观察发现hUC-MSC分泌因子可促进人原代真皮成纤维细胞表达I型胶原蛋白。5.大鼠皮肤创口修复实验表明,hUC-MSC条件培养基液和其脂质体制剂均可以促进创伤的修复,创口及周边组织石蜡切片HE染色后,光镜下观察可见:空白对照组与空白脂质体对照组,创面修复缓慢,真皮层及创面深层未见腺体和毛囊生成,有组织水肿;干细胞分泌因子组,早期大鼠皮肤创面有肉芽组织生成,大鼠皮肤表皮层加厚,真皮层创面肉芽组织增加,有大量新生血管,创面下腺体与毛囊增多;hUC-MSC分泌因子脂质体组,早期大鼠皮肤创面有肉芽组织生成,表皮层加厚大鼠皮肤创面肉芽组织增加,有大量新生血管生成,创面下及皮肤深层的腺体与毛囊增多。结论:1.贴壁培养法可获得高纯度且形态均一的hUC-MSC。2.可用无血清的基础培养基获得无动物源性的干细胞分泌因子(条件培养基)。3.干细胞分泌因子可以促进人原代真皮成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋。4.干细胞分泌因子及其脂质体囊泡均可促进大鼠皮肤缺损的创伤修复。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文2 结 果2.1 hUC-MSCs 形态学观察结果自组织块接种培养第二周时，可在倒置显微镜下观察到一些零星的、状的细胞从组织块周围爬出，细胞形态大小不规则。随着细胞的缓慢增殖由短梭形态演变成长梭形态，并逐渐形成旋涡状的细胞集群。待细胞生长融合后进行传代，随着传代次数的增加，在倒置显微镜下观察可见细胞呈大小形态均一，细胞群紧密排列，呈现旋涡状或平行状生长（图 1-1）。

.3 hUC-MSCs 的成骨细胞诱导分化加入成骨细胞诱导培养基的 P3 代 hUC-MSCs，与对照组相比，生长缓慢，培养的第 8-10d，其形态发生改变且随着诱导时间的延长呈现重叠生长。在成诱导 28d 后，经茜素红染色，在显微镜下观察可见茜素红染色呈阳性，对照组染色呈阴性（图 1-3）。这一实验结果表明所提取的 hUC-MSCs 可被诱导分化胞。图 1-2 P3 代 hUC-MSCs 表面标志蛋白检测结果A.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD105 的表达; B.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD44 的表达;C.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD29 的表达; D.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD45 的表达;E.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD34 的表达

2.3 hUC-MSCs 的成骨细胞诱导分化加入成骨细胞诱导培养基的 P3 代 hUC-MSCs，与对照组相比，生长缓慢，在诱导培养的第 8-10d，其形态发生改变且随着诱导时间的延长呈现重叠生长。在成骨细胞诱导 28d 后，经茜素红染色，在显微镜下观察可见茜素红染色呈阳性，对照组茜素红染色呈阴性（图 1-3）。这一实验结果表明所提取的 hUC-MSCs 可被诱导分化为骨细胞。图 1-2 P3 代 hUC-MSCs 表面标志蛋白检测结果A.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD105 的表达; B.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD44 的表达;C.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD29 的表达; D.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD45 的表达;E.hUC-MSCs 表面标志蛋白 CD34 的表达
【参考文献】

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1 张水华;李云富;王妍;;脂质体包裹蛋白质药物的制备及影响因素的控制[J];药学进展;2006年01期

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1 王黎明;脐带间充质干细胞的分泌蛋白表达谱研究[D];安徽医科大学;2014年

本文编号：2872532