表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建、鉴定与免疫研究

发布时间：2020-11-07 08:58

　　目的研制一种可同时预防棘球蚴病与狂犬病的重组活载体疫苗。方法利用反向遗传技术,将细粒棘球蚴Eg95基因ORF区插入狂犬病病毒弱毒SAD株基因组的假基因区,得到全长感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,拯救获得重组狂犬病病毒SAD-EG95株。结果重组病毒SAD-EG95株经RT-PCR与免疫荧光鉴定,表明重组病毒基因组中包含细粒棘球蚴Eg95基因,且能表达EG95蛋白。该重组病毒能在BHK-21和NA细胞中复制,病毒生长曲线与亲本株SAD差异较小,且传代稳定性良好,能在小鼠模型中诱导产生狂犬病病毒和细粒棘球蚴特异性保护抗体。结论成功构建表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组狂犬病病毒,为进一步研制预防狂犬病和细粒棘球蚴的二联疫苗奠定了基础。
【部分图文】：

血清,抗体,中和抗体,效价

在小鼠体内进行初步免疫评价，免疫SAD株和SAD-EG95株4周后，经FAVN法检测小鼠血清中RABV中和抗体水平。亲本SAD组和重组SAD-EG95组的血清内均可检测到抗RABV中和抗体，SAD组中和抗体效价约为2.08 IU/ml,SAD-EG95组效价约为6.37 IU/ml，均高于WHO认定的具有有效保护能力的抗体水平（0.5 IU/ml）。SAD-EG95组小鼠血清抗体滴度略高于SAD组小鼠，表明重组病毒具有诱导机体产生RABV中和抗体的能力（图6A）。2.7 ELISA法检测EG95特异性抗体

质粒,基因,片段,琼脂糖

对阳性质粒进行Pfl23Ⅱ和NheⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳观察经酶切后阳性质粒出现两条带，分别与预测的载体pSAD质粒全长基因片段（17 kb）和细粒棘球蚴Eg95基因片段（471 bp）大小相符（图1），结果表明含有Eg95基因的重组全长感染性克隆pSAD-EG95构建成功。2.2重组病毒的IFA鉴定

标尺,荧光,病毒,假基因

提取SAD和SAD-EG95病毒的总RNA，反转录后以特异性引物SADInsert进行PCR扩增，其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示，SAD样本仅扩增出假基因区，而重组病毒SAD-EG95样本扩增出目的条带约为800 bp（图3）。上述结果进一步表明，重组病毒成功插入外源基因Eg95。图3 SSAADD‐‐EEGG95 RRTT‐‐PPCCRR鉴定
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