氨基酸特征谱的构建及其在高脂血症研究中的应用

发布时间：2020-11-09 06:42

　　 背景:氨基酸是构成生命物质基础的基本单位。正常生理状态下,生物体内的氨基酸谱处于一种平衡状态,氨基酸谱的失衡是众多疾病的诱因或表现形式。研究表明,氨基酸谱在健康评估、疾病诊断、疗效评价等生物医学研究领域中的应用日益广泛,氨基酸谱是研究重大代谢性疾病及其防控策略的重要技术手段之一。郭姣教授首次提出―糖脂代谢病‖(GLMD)创新理论,认为GLMD以糖脂代谢紊乱为特征,涉及神经内分泌失调、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症和肠道菌群失调五项核心病理病机,但GLMD氨基酸谱的动态变化特征尚不明确。高脂血症作为最常见的糖脂代谢病临床表现形式,如何有效防控高脂血症是一项重大而艰巨的任务。田黄方(THP)是郭姣教授根据长期临床经验总结的代表方,对高脂血症具有明显疗效。前期研究表明,THP除了显著降脂之外,还参与调节氧化应激、炎症、氨基酸代谢、能量代谢等。然而,目前尚无基于氨基酸全谱表征高脂血症以及THP的干预机制研究。目的:建立血浆氨基酸的定性定量分析方法,构建高脂血症氨基酸特征谱,基于氨基酸特征谱研究THP干预高脂血症的作用及机制。方法:1.血浆中氨基酸的指纹图谱研究:采用UPLC-Q/TOF MS分析技术对空白大鼠血浆氨基酸进行综合定性分析,包括直接定性和衍生化定性;对血浆氨基酸进行AQC衍生后,优化液相色谱和质谱条件并进行方法学考察,建立血浆氨基酸的AQC柱前衍生结合UPLC-QDa的定量分析方法。2.高脂血症氨基酸特征谱的构建:分别采用高脂乳剂灌胃、20%高果糖自由饮食和高脂饲料饲喂三种方式建立高脂血症大鼠模型,采用生化分析仪检测血糖血脂指标评价模型。采用已建立的方法对高脂血症大鼠血浆氨基酸进行定量分析,结合多元统计分析发现高脂血症血浆中的氨基酸类生物标志物,构建高脂血症氨基酸特征谱。进一步采用网络药理学研究方法分析特征氨基酸的靶点和信号通路,阐释特征氨基酸的生物学意义。3.THP对高脂血症特征氨基酸的干预作用:以高脂血症小鼠血浆为研究对象,基于AQC柱前衍生结合UPLC-QDa分析技术对氨基酸进行定量分析,结合多元统计分析发现氨基酸类生物标志物,构建高脂血症氨基酸特征谱并研究THP对高脂血症特征氨基酸的干预作用。结果:1.血浆氨基酸的指纹图谱研究综合采用直接和衍生化分析方法,空白大鼠血浆中共鉴定出52种氨基酸。采用AQC柱前衍生结合UPLC-QDa分析技术,在10.7 min内可同时定量分析36种氨基酸。2.高脂血症氨基酸特征谱的构建采用高脂乳剂灌胃、20%高果糖自由饮食和高脂饲料饲喂三种方式建立了高脂血症大鼠模型,血糖血脂指标及氨基酸均出现代谢紊乱。血浆氨基酸谱可有效判别正常组和高脂血症模型组大鼠,所构建的高脂血症氨基酸特征谱共计20个氨基酸,包括Glu、Sar、β-AIB、Cys2和Pip 5个共同氨基酸,其变化趋势是Glu和Sar均出现降低,β-AIB、Pip和Cys2升高或降低。以上高脂血症特征氨基酸存在3个共同靶点,即PTGS1、PYGM和PTGS2,预测参与调节脂肪细胞中的脂肪分解、淀粉和蔗糖代谢、胰岛素抵抗等信号通路。3.THP对高脂血症特征氨基酸的干预作用高脂血症小鼠血浆氨基酸谱共计13个氨基酸,包括Pip、Ser、Ala、Met、Aad、β-AIB、Car和Asn,其变化规律是Pip、Ser、Ala、Met、Aad、β-AIB、Car和Asn水平升高,而Sar、Phe、Ile、Orn和Val水平降低。在药物作用上,THP对血浆Sar、Aad、β-AIB和Car具有调节作用。与阿托伐他汀相比,THP可独特调节Sar,预测作用于PPIG和GNMT高脂血症靶点,参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路。结论:本研究鉴定出了大鼠血浆中的52种氨基酸,建立了10.7 min内同时定量36种氨基酸的AQC柱前衍生UPLC-QDa分析方法。高脂乳剂灌胃、20%果糖饮食和高脂饲料饲喂三种方式下的大鼠高脂血症血浆中氨基酸代谢出现紊乱,氨基酸谱可用于表征高脂血症。在干预作用方面,血浆氨基酸谱也可用于表征THP给药后小鼠体内代谢改变。与阿托伐他汀相比,THP可独特调节血浆Sar,预测其作用于PPIG和GNMT高脂血症靶点,参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R589.2;R-332
【部分图文】：

广东药科大学硕士研究生学位论文1.1.2 氨基酸及其生物学意义概述氨基酸是构成生命物质基础的基本单位，参与调节机体的生理功能并类、脂肪、核苷酸等密切相关。目前，自然界中发现的氨基酸有 300 多种常见的 20 种蛋白质氨基酸外，越来越多的研究发现其他一些氨基酸不仅为基因表达和蛋白磷酸化级联的调节因子，而且也是合成激素和低分子量物质的关键前体，具有重要的生物学意义[10-11]。

图 1-2 技术路线图1.6 研究意义与创新性1.6.1 研究意义（1）完善 GLMD 的生物标志物体系，为 GLMD 创新理论提供进一步的支持；（2）为高脂血症发病机制及降脂中药研发提供思路。1.6.2 创新性（1）首次将氨基酸谱作为表征不同诱因下的高脂血症以及 THP 给药前后代谢改变的一种新策略；（2）结合氨基酸分析与网络分析探索氨基酸在高脂血症中的生物学意义。

图 2-1 37 种氨基酸混标溶液（a）和血浆样品（b）TIC 图.4 讨论为最大化提取血浆中的氨基酸，首先对样品前处理方法进行选择。据道，血浆样品中氨基酸提取方法以酸提取、有机溶剂提取等方法为主，除蛋白质，防止其阻塞色谱柱引起流速下降且不稳定而影响分离效果。杨酸是提取血浆中氨基酸最普遍的方法，浓度 5-20%不等[59-60]，与样品比例混合离心去除蛋白，也常用如甲醇、乙腈或提取缓冲液使样品中的变性，然后高速离心达到彻底去除样品中的蛋白质[15, 61]。本节采用 20%水杨酸、5%的磺基水杨酸、乙腈、提取缓冲液等试剂进行氨基酸的提取采用 LC-MS 检测，以氨基酸种类和质谱响应为评判标准，最终选择以 磺基水杨酸为提取溶剂。其次，对氨基酸的色谱、质谱条件进行优化选
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本文编号：2876047