miR-411及MMP-13在SD大鼠骨关节炎模型中的表达

发布时间：2020-11-09 07:47

　　 目的:本实验通过采用前交叉韧带横断加内侧半月板切除的方法构建SD大鼠骨关节炎(OA)模型,观察其大体变化,向OA大鼠模型的关节腔内注射慢病毒介导的微小RNA(miRNA)-411,使软骨组织中表现出miR-411过表达及低表达状态,并检测基质金属蛋白酶(MMP)-13、Ⅱ型胶原和Ⅳ型胶原的表达,从而研究miR-411及MMP-13对大鼠OA模型中软骨损伤的作用,对miR-411在OA发生发展中的作用机制进行了初步的研究。方法:构建SD大鼠OA模型,取8-10周龄,体重为280-300g雄性SD大鼠40只,随机分为4组:A组为手术组;B组为手术联合注射miR-411 mimics;C组为手术联合注射miR-411 inhibitor;D组为假手术联合注射miR-411 LV阴性对照组(每组10只)。手术组行右膝前交叉韧带横断加内侧半月板切除。对照组仅打开关节囊,不破坏前交叉韧带和内侧半月板,在OA模型手术后的第7天和第14天将100uL慢病毒介导的miR-411 mimics(3*10~8 TU/ml),miR-411 inhibitor(2?3*~8 TU/ml),miR-411 LV阴性对照(5*10~8 TU/ml)分别注射到相应分组的SD大鼠OA模型的膝关节腔内。4周后处死所有大鼠,取大鼠的关节软骨,对软骨情况进行大体的观察,应用qRT-PCR检测miR-411在关节软骨组织中的表达情况,利用Western Blot对关节软骨中的MMP-13、Ⅱ型胶原和Ⅳ型胶原的表达水平进行检测。结果:1.在SD大鼠OA模型中,手术组4周后的胫骨平台关节软骨表面尚平滑,略粗糙,失去正常光泽,颜色较正常颜色略黄,局部软化。假手术组软骨则无明显退行性改变。2.通过qRT-PCR检测不同分组中软骨组织的miR-411表达情况,发现在假手术组及LV阴性对照组中的表达水平尚无明显改变。而在过表达组中,miR-411的表达水平显著上调(P0.05),低表达组中miR-411的表达水平显著下调(P0.05)。3.通过Western Blot检测造模后的MMP-13、Ⅱ型胶原和Ⅳ型胶原的表达情况,发现在在手术组中MMP-13的表达较假手术组升高,而II型胶原和IV型胶原的表达降低;在miR-411过表达组中则发现MMP-13的表达水平降低,而II型和IV型胶原的表达略增加;而miR-411低表达组则情况相反,MMP-13的表达增加,而II型和IV型胶原的表达降低。发现miR-411随着关节软骨退行的程度加深而表达水平呈下降趋势,而MMP-13的表达则随着关节软骨退行的程度加深而表达水平呈上升趋势,II型胶原和IV型胶原的表达则与miR-411表达趋势相似。结论:1.验证了通过采用前交叉韧带横断加内侧半月板切除的方法可以构建SD大鼠OA模型,该手术方法操作简单,创伤较小,可重复性高,适合骨性关节炎动物模型的建立。2.miR-411在SD大鼠OA模型软骨组织中呈低表达,而MMP-13在软骨组织中呈高表达,两者呈现显著的负相关关系,共同作用于骨性关节炎软骨组织的退变过程中。本研究通过关节腔内注射慢病毒构建miR-411异常表达的模型,发现miR-411的表达水平同OA发展的严重程度密切相关,当miR-411过表达时可以通过靶向抑制MMP-13的表达来延缓OA进程中软骨退变程度,在OA的发生发展中扮演重要角色,为OA发病机制的探索及OA新型靶向治疗提供了新思路。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R684.3;R-332
【部分图文】：

取仰卧位，术者带手术帽、口罩，洗手消毒后戴无菌手套，对大鼠右下巾，首先触及右膝关节髌骨位置，在其内侧 1cm 左右位置行纵行切口，长约 切开剥离，直至暴露膝关节腔，然后假手术组逐层缝合各层组织，不破坏任手术组将髌骨向外侧脱位，然后屈曲膝关节，将前交叉韧带及内侧半月板充术中注意保护内侧副韧带，然后直视下将前交叉韧带完全横断，注意避免术带发生增生黏连，随后使用眼科剪将内侧半月板切除，最后将髌骨复位后，水及碘伏冲洗关节腔，使用 5-0 缝线完整关闭关节腔，逐层缝合切口，刀口大鼠清醒后回笼饲养，自由活动，不固定术侧下肢。术后前三天给与注射青感染，每 3 天更换一次垫料，每天观察大鼠生命状态，确保右下肢可正常活动OA 模型手术后的第 7 天和第 14 天将 100uL 慢病毒介导的 miR-411 m*108TU / ml）、100uL 慢病毒介导的 miR-411inhibitor（2*108TU / ml）注射到的大鼠膝关节腔内，将 100uL 慢病毒介导的 miR-411 LV 阴性对照（5*108TU 到假手术组大鼠膝关节腔内，4 周后处死所有组别的大鼠并收集膝关节标本的胫骨平台、股骨内外侧髁及髌股关节处的软骨及软骨下骨，放置于液氮中保

结果结果1 大鼠胫骨平台关节面大体观察各组小鼠均存活至实验完成，未发生感染、死亡等情况，动物模型制备完成后手术组组大鼠右膝关节活动受限明显，假手术组未见明显异常。手术组 4 周后可见膝胫骨平台关节软骨表面尚平滑，略粗糙，失去正常光泽，透明度下降，颜色较正颜色略黄，局部软化。假手术组软骨则无明显退行性改变。

手术组 miR-411 mimics miR-411 inhibitor 假手术组图 3 Western Blot 检测 MMP-13、II 型胶原和 IV 型胶原的表达RT-PCR 结果通过 qRT-PCR 检测不同分组中软骨组织的 miR-411 表达情况，发现在所有 OA软骨中均有 miR-411 表达，其中在假手术组及 LV 阴性对照组中 miR-411 的表达尚无明显改变。而在过表达组中，miR-411 的表达水平显著上调（P＜0.05），低组中 miR-411 的表达水平显著下调（P＜0.05）。
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本文编号：2876115