Aicardi-Goutieres综合征相关基因SAMHD1敲除大鼠模型的构建及分析

发布时间：2020-11-11 03:24

　　 研究背景及目的Aicardi-Goutières综合征(Aicardi-Goutières syndrome,AGS)是一种罕见的遗传性神经系统疾病,多发于新生儿,被认为是一种自身免疫性疾病。AGS临床表现为亚急性脑脊髓炎,伴有脑萎缩、颅内钙化、脑白质病变、脑脊液淋巴细胞增多以及干扰素α(Interferonα,IFN-α)水平异常升高。研究发现SAMHD1(Sterile alpha motif domain and histidine/aspartic acid domain-containing protein1)基因发生突变可以引起AGS。2013年两个独立的研究小组几乎同时建立了SAMHD1缺陷小鼠模型,发现SAMHD1缺陷小鼠腹腔或骨髓来源巨噬细胞中Ⅰ型干扰素诱导基因表达上调,但是其未出现严重的自身免疫病症状。2015年Kasher PR等建立了SAMHD1缺陷的斑马鱼模型,此模型能出现类似人类AGS的脑部症状。然而,斑马鱼不是哺乳动物,不太适合用来研究人类AGS产生的分子机制和靶向治疗。大鼠神经系统与人类相似,SAMHD1基因缺陷大鼠很可能是研究人AGS的理想动物模型。本研究的目的是建立SAMHD1基因敲除大鼠模型并观察此模型是否出现类似人AGS的症状,为深入研究AGS致病机制和靶向治疗奠定基础。方法(1)CRISPR/Cas9技术构建SAMHD1基因敲除大鼠及PCR鉴定a)sgRNA设计及构建:设计针对SAMHD1基因第四个外显子的sgRNA,构建sgRNA。b)原核注射及移植:对大鼠进行超排卵处理;将sgRNA注射至受精卵、移植得到F0代大鼠。c)F0代大鼠鉴定及繁育:通过PCR和测序验证敲除(KO)阳性大鼠;将阳性F0代大鼠和SD大鼠回交。d)F1代大鼠鉴定:通过PCR和测序验证阳性F1大鼠。e)将F1代杂合子大鼠配笼繁育,对配繁出生的大鼠进行PCR及测序鉴定,获得SAMHD1敲除的F2代纯合子大鼠。将F2代纯合子大鼠配笼繁育,获得一定数量SAMHD1敲除的纯合子大鼠后开展后续研究。(2)检测SAMHD1缺陷大鼠各器官和组织SAMHD1的表达情况蛋白质印迹法Western Blot检测SAMHD1在各器官和组织的表达情况。(3)SAMHD1缺陷大鼠脑部是否有病变?a)磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)检测SAMHD1缺陷大鼠有无出现脑萎缩、颅内钙化和白质病变。b)Morris水迷宫方法检测SAMHD1缺陷大鼠的定位航行和空间探索能力。(4)SAMHD1缺陷大鼠是否有Ⅰ型干扰素异常升高的自身免疫病症状?抽取8周左右SAMHD1缺陷大鼠外周血,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测IFN-α、β水平。(5)SAMHD1缺陷大鼠哪些器官和组织Ⅰ型干扰素表达水平升高?取8周左右SAMHD1缺陷大鼠各器官和组织,免疫组化、qRT-PCR检测各器官和组织是否高表达IFN-α、β。结果(1)PCR及测序结果显示获得3只KO阳性的F0代大鼠。其中24号是-184 bp敲除,25号是-346 bp敲除。(2)PCR及测序结果显示F1代32、33号为-184 bp敲除杂合子大鼠,53、56、57号为-346 bp敲除杂合子大鼠。(3)将F1代-346 bp敲除杂合子进行配笼繁育,共获得F2代大鼠9只,其中纯合子(SAMHD1-/-)3只(85、86、88号),杂合子(SAMHD1+/-)4只(87、89、90、91号),野生型2只(92、93号)。(4)Western Blot结果显示在SAMHD1缺陷纯合子大鼠各器官和组织中,SAMHD1基因被敲除,无法正常表达。(5)磁共振成像结果显示8周SAMHD1缺陷大鼠无明显的脑萎缩、颅内钙化和白质病变。(6)ELISA结果显示与野生型大鼠相比较,8周SAMHD1缺陷大鼠外周血血清中,IFN-α、β水平有明显上升。(7)免疫组化、qRT-PCR结果显示8周SAMHD1缺陷大鼠各器官和组织高表达IFN-α、β。结论成功构建SAMHD1敲除大鼠模型,并发现此模型有Aicardi-Goutieres综合征相关的Ⅰ型干扰素高表达现象。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R596;R-332
【部分图文】：

32图 1.CRISPR/Cas9 技术构建 SAMHD1 基因敲除大鼠 A.大鼠 SAMHD1 基因结构示意图。展示了大鼠 SAMHD1 基因的部分片段。灰色部分为 UTR 非编码区，橙色部分为外显子。设计的 sgRNA 和切除位点就位于第四外显子上。B.SAMHD1 第四外显子的碱基序列。5S1、5S2、3S1、3S2 均为 sgRNA 结合作用的位置。F0-tF1、F0-tR1 和 WT-tF1、F0-tR2 为鉴定大鼠基因是否敲除的引物 C.设计的 sgRNA 的名称及其碱基序列。

0代大鼠PCR鉴定：A.PCR电泳结果

安徽医科大学硕士学位论文NA，N为空白对照；DL2000条带，从上到下条带依次为2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp.B为鉴定的结果，24，25，27第四外显子全部删除，KO阳性。Figure2.PCR identification of F0 generation rats:A.The result of PCRelectrophoresis.SD is the negative control.it is the DNA of SD genome.N is the blankcontrol;DL2000 band,from top to bottom band,is 2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp.B.The result of identification.All the fourth exons of 24th, 25th, 27th rat aredeleted and KO is positive.AB
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本文编号：2878677