装载肿瘤抗原多肽的聚（β-氨基酯）纳米疫苗的制备及评价

发布时间：2020-11-12 17:19

　　 目的:肿瘤免疫治疗过去20年的发展引起了研究者对于抗肿瘤疫苗的关注。基于树突状细胞(DCs)利用纳米技术制备的抗肿瘤疫苗是一种有效的激发体内特异性免疫反应的途径,近年来国内外都有广泛的研究。聚(β-氨基酯)阳离子聚合物(PBAE)具有合成简单,结构易修饰,生物可降解性以及pH敏感等性质,是一种极具潜力的抗原载体,能够在体内装载并保护抗原,递送至DCs细胞识别呈递,刺激免疫反应的发生,发挥特异性的抗肿瘤免疫作用。方法:本研究通过经典的迈克加成反应合成聚(β-氨基酯)类聚合物,通过硬脂胺(SA)的修饰包载肿瘤相关抗原(TAA)多肽Trp-2和免疫佐剂单磷酰脂质A(MPLA),制备成纳米疫苗,并通过甘露糖的封端修饰,增加T/M@mPS纳米疫苗的DCs细胞靶向性。通过核磁共振氢谱(~1H-NMR),傅里叶变换红外光谱(FTIR),动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法确认聚合物结构和纳米粒形态。同时利用小动物活体成像、流式细胞术和酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法在细胞和动物实验中验证T/M@mPS纳米疫苗的靶向性以及激发体内抗肿瘤免疫反应的能力。为了进一步提高纳米疫苗的疗效,在小鼠黑色素瘤模型中利用PBAE纳米疫苗与免疫检查点PD-L1抑制剂联合治疗,对其联合治疗的预防和免疫效果进行评价。结果:PBAE聚合物可以较好地包载肿瘤相关抗原多肽Trp-2,并形成粒径为150nm左右的稳定纳米粒。甘露糖的修饰使纳米疫苗在体内外都具有较好的靶向性,并可以刺激DCs细胞熟化,进而增强体内杀伤性T细胞的增殖分化。联合PD-L1疗法后,显示出更强的抗肿瘤免疫效果。结论:PBAE聚合物作为一种结构易调控的阳离子聚合物载体,促进了抗原多肽的递送,激发了体内特异性的免疫反应,在多肽疫苗的构建上具有广泛的应用前景,为肿瘤免疫治疗提供了新思路。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

/M@mPS纳米疫苗的制备及其激活免疫效应流程图

图 2 man-PBAE-S 的合成路径图（1）反应前，溶剂 DMF 用足量 CaH2浸泡两天除水，然后过滤在干燥器中保存。DCM 先用 CaH2浸泡两天后，重蒸后得到无水 DCM，放在干燥器中保存；（2）man-PBAE-S 聚合物通过两步迈克加成反应得到。第一步为 PBAE-S 的聚合。硬脂胺（SA），1,4-丁二醇二丙烯酸酯（BDD）和 4,4’-三亚甲基二哌啶（TDP）按照摩尔质量比 1:9:10 和 0.5:9.5:10（质量 0.27g：1.78g：2.1g；0.14g：1.88g：2.1g）称取，溶解到 5mL 无水 DMF 中。鼓氮排氧后，在 90oC 油浴锅里反应 72 小时；（3）反应完成后，反应液冷却至室温，用 50mL 二氯甲烷稀释，此时有少量絮状物析出。减压抽滤除去絮状物，DCM 洗涤后，收集滤液。旋转蒸发仪抽去滤液中的溶剂，得到淡黄色的粗产物；（4）粗产物用少量 DCM 溶解后，装入分子量为 1000 的透析袋（透析袋提前活化），用 DCM 和 DMF 的混合溶剂(1:1, v:v)透析两天，除去没有反应完的单体。两天后，

图 3 PBAE、PBAE-S、man-PBAE-S 核磁共振氢谱图（H-NMR）由于前期的研究发现单纯的 PBAE 对疏水性多肽 Trp-2 的包封率不高，多肽损失较大。引入硬脂胺单体，增加主链段的疏水能力，提高多肽的包封率，使 PBAE成为一种可调控的多肽载体。甘露糖胺的加入，使其结构上的胺基与 PBAE 两端的烯键加成，成为具有甘露糖受体靶向的聚合物载体，帮助 PBAE 纳米粒在体内外靶向 DCs 细胞，增强其递送抗原的精准性，提高疫苗的疗效。PBAE、PBAE-S、man-PBAE-S 的核磁氢谱如图 3 所示，PBAE 和 PBAE-S 在5.8 到 6.5 的范围内有明显由两个 d 峰，一个 dd 峰构成的双键峰型。化学位移在4.07(f)、1.67(h) ppm 位置上的信号是典型属于 BDD 结构单元上-CH2CH2-O-CO-的质子化学位移。而化学位移在 2.63(d)、2.48(d’)、1.60(e)、1.15(e’,i) ppm 位置上的信号同样是典型的属于 TDP 结构单元上哌啶环内-N-CH2CH2CH 上质子的信号。2.85(c)、1.91(g)的形成说明了 BDD 上的双键和 TDP 上的二级胺加成形成了新的碳氮键，说明 PBAE 合成成功。在 PBAE-S 和 man-PBAE-S 的氢谱图上出现了硬脂胺链上亚甲
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本文编号：2881016