结核分枝杆菌RNA解旋酶RhlE的蛋白表达、纯化及结构性质研究

发布时间：2020-11-13 09:26

　　 结核分枝杆菌引起的结核病危害严重,是传染性较强的全球慢性感染病之一,具有潜伏感染的特性.结核分枝杆菌来源的RNA解旋酶RhlE依赖于ATP水解活性,参与RNA代谢,调节核糖体的装配与降解,但是其催化机制和结构基础尚不清楚.本文对RhlE进行了体外表达纯化、动态光散射和酶活性检测研究.结果表明RhlE在大肠杆菌内高效表达,动态光散射(DLS)分析显示其主要以单体的形态分布在溶液中.在ATP/Mg离子的辅助下可以高效解旋双链RNA,小角散射实验表明RhlE具有与同源家族蛋白类似的三维结构.
【部分图文】：

RhlE蛋白的SAXS分析

酶活性质测定所用的RNA底物均购自金唯智公司，序列如下：Cy5标记的RNA单链，Cy5-5′-GCUUUACGGUG-3′；Cy3标记的RNA单链，5′-AACAAAACAAAAUAGCACCGUAAAGC-3′-Cy3；未标记的RNA单链，5′-UAGCACCGUAAAGC-3′．RNA粉末溶于DEPC水，Cy5标记的RNA单链与Cy3标记的RNA单链共20μmol/L，在75mmol/L KCl和10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5）缓冲液中室温孵育10min，构成复合物底物（图1）．此复合物在解旋酶RhlE的解旋作用下打开双链，Cy3荧光强度增强，由Cy3至Cy5的荧光偏振强度减弱．RhlE解旋缓冲液为：10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5),60mmol/L NaCl,55mmol/L KCl,5%（体积比）甘油．反应体系包括20nmol/L双荧光基团复合物，0.2μmol/L未标记的RNA单链，和2mmol/L ATP/Mg，最后加入RhlE蛋白（0.6μmol/L）．底物荧光基团（Cy3）在500nm波长处激发，565nm波长处发射．与此同时，Cy3到Cy5两荧光基团的荧光共振能量转移由540nm波长处激发，由665nm波长处发射．参考文献[23]，通过M5e酶标仪（美谷分子仪器上海有限公司SpectraMax M5）进行检测，所有实验均有3组平行．

为了揭示蛋白RhlE的潜在催化活性位点，将RhlE和DEAD-box家族的其他同源酶类（包括嗜热脂肪芽孢杆菌来源的CshA，幽门螺旋杆菌来源的RhpA，蜡样芽胞杆菌来源的CshE，豌豆蚜来源的DeaD）进行了多序列同源比对，结果见图2．二级结构比对是基于CshA的晶体结构通过Clustal W(https：∥www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行的，然后用ESPript3.0(http：∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgibin/ESPript.cgi）进行显示．结果表明RhlE与其他几个酶均具有较多共有的区域，这表明RhlE确实属于DEAD-box家族．2.2 RhlE蛋白的表达和纯化
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本文编号：2882038