鼠衣原体tc0668单基因差异型菌株体外感染差异蛋白及相关通路的筛选

发布时间：2020-11-14 17:31

　　 鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)tc0668是参与鼠衣原体致小鼠输卵管炎症病变的染色体基因。将获得的TC0668未突变单克隆菌株(Cm TC0668~(wt))与TC0668突变的单克隆菌株(Cm TC0668~(mut))同时接种小鼠建立小鼠生殖道感染模型,与Cm TC0668~(wt)菌株相比,Cm TC0668~(mut)菌株致小鼠生殖道病变率大大减低。本课题组前期的研究工作中发现,TC0668蛋白是定位于衣原体原体(Elementary body,EB)/网状体(Reticulate body,RB)膜上的结构蛋白,且在鼠衣原体发育周期的中后期(16 h左右)表达相对较高,该蛋白通过调控宿主细胞炎症因子的分泌参与衣原体致病。但TC0668在Cm致病过程中的分子机制尚不明确。由于TC0668是一种新发现的毒力因子,缺乏可供参考的同源蛋白进行致病机制的研究和分析,我们需要一种有效的技术方法对可能参与TC0668致病的相关分子和信号通路进行全面的筛选和分析。同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ技术)是近年来新开发的比较先进的标记型蛋白质组学定量研究技术,该技术应用于蛋白质组学筛选差异蛋白灵敏度高,检测平行性和稳定性较好,适用范围广,检测通量高,目前已经运用到多种病原菌致病机制的研究。目的通过Cm TC0668~(wt)菌株和Cm TC0668~(mut)菌株分别感染HeLa细胞构建细胞感染模型,经iTRAQ标记结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术建立两种菌株HeLa细胞感染样品的差异蛋白数据库,分析差异蛋白的来源及生物功能,筛选可能参与TC0668致病的相关分子和信号通路。方法将Cm TC0668~(wt)菌株与Cm TC0668~(mut)菌株分别感染HeLa细胞,在6 h、12 h、18 h、24 h收集感染细胞样品,采用iTRAQ技术结合LC-MS/MS技术分析样品成分,建立多个样品的全细胞蛋白表达谱,应用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4软件进行查库鉴定和定量分析,构建两种菌株细胞感染模型的差异蛋白数据库;应用Blast2GO、KAAS及CytoScape等生物信息学方法对差异蛋白进行基因本体(GO)分子功能注释、KEGG信号通路及蛋白质相互作用分析,预测差异表达蛋白的生物学功能和参与的信号通路;qRT-PCR和Western blotting分别从mRNA水平和蛋白水平验证差异蛋白检测结果;并进一步鉴定相关信号通路关键分子PI3K和NF-κB的表达。结果成功建立了感染指数(Multiplicity of infection,MOI)为1,可平行对照的Cm TC0668~(wt)菌株和Cm TC0668~(mut)菌株的HeLa细胞感染模型,感染细胞样品经iTRAQ标记结合LC-MS/MS质谱技术在衣原体发育的中后期(感染后18 h)共鉴定了550个差异表达蛋白,与Cm TC0668~(wt)感染细胞样品相比,Cm TC0668~(mut)感染细胞样品中222个蛋白表达上调,328个蛋白表达下调。经GO功能分析,差异表达蛋白主要与细胞的结合活性、催化活性、转运分子活性、分子功能活性和转录调节活性等相关。GO功能注释显示:差异蛋白的功能主要涉及分子功能、细胞组分和生物过程三方面。生物过程包括:纤溶酶原活化的调控、防御反应负调节、角化作用及脂质反应负调控。分子功能包括:组成表皮结构、生长因子结合、受体活性及胆固醇结合等。细胞组分包括:膜成分、高密度脂蛋白颗粒及角蛋白纤维等。蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析显示:各差异表达蛋白之间存在着直接或间接的相互作用。KEGG通路分析显示:差异蛋白与多条信号通路相关,主要涉及了补体和凝血级联、PPAR信号通路、Fc gamma R介导的吞噬、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路及NOD样受体信号通路等;随机挑取10个差异蛋白进行mRNA水平的qRT-PCR,证实Cm TC0668~(wt)感染细胞样品中IFI16、TRAFD1和MAPKAPK2蛋白的mRNA表达水平上调,SRPRB、JAK1、BCAP31、THBS1、PMM1、ITPR1和HLA-DQB1蛋白的mRNA表达水平下调,与蛋白质组学检测结果一致。Western blotting验证JAK1蛋白表达水平,JAK1表达量在TC0668~(wt)样品组中随着感染时间延长而增加,TC0668~(mut)样品组JAK1的表达逐渐减弱,与蛋白质组学检测结果一致。在信号通路活化的检测中,结果显示:Western blotting检测两组细胞感染样品中NF-κB表达水平均随着感染时间逐渐增加,TC0668~(wt)组NF-κB分子上调水平明显高于TC0668~(mut)组,并且,IFA检测TC0668~(mut)与TC0668~(wt)菌株感染的HeLa细胞中NF-κB的活化情况,TC0668~(wt)组中,随着感染时间的增加,NF-κB逐渐入核,且24 h全部入核,TC0668~(mut)组的NK-kB从感染后6 h到24 h逐渐入核,24 h仍有少量NF-κB位于核外;两组细胞样品的ERK磷酸化水平无明显差异;TC0668~(wt)组PI3K分子的表达水平明显高于TC0668~(mut)组,而且,作为PI3K信号通路上重要表达分子,肿瘤抑制因子p53在感染中后期的的表达水平也明显低于TC0668~(mut)组。结论两组在tc0668上存在单基因差异的两种衣原体菌株感染细胞所引起的宿主差异蛋白,可能参与细胞代谢、免疫应答和生物调控过程;鼠衣原体TC0668可能通过PI3K、NF-κB等信号通路来发挥致病作用。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R374
【部分图文】：

B. TC0668mutA. TC0668wt图 1 荧光显微镜下 40 倍下检测衣原体感染 HeLa 细胞 24 h 形成的包涵体数目Fig.1 Fluorescence microscopy was used to detect the number of inclusion bodiesformed by chlamydia strain in 24 hours after infection with HeLa cells(×40).

PCR 检测 Cm TC0668wt-HeLa 细胞与 Cm TC0668mut-HeLa 细胞p8 的 gene copy number同时间点两组菌株感染细胞后的 DNA（设置三个重复样本），测并获得八组样本 tc0668 与 pgp8 的 Cq 值，根据标准曲线公式获得gene copy number。结果分析，pgp8 在两组菌株感染的 HeLa 细胞中接免疫荧光法检测感染了 Cm TC0668wt或 Cm TC0668mut菌株的 HeLa 细胞。光 20 倍下分别在 6、12、18 和 24 h 拍摄到感染衣原体的 HeLa 细胞，其中 TC0668wt68mut包涵体均可在每小时 12 h 内被观察到，TC0668 蛋白(红色)仅在 18 和 24 h的 TC0668wt包涵体中可见ndirect immunofluorescence assay (IFA) of HeLa cells infected with Cm TC0668wtor68mutstrain. Chlamydia-infected HeLa cells cultures were photographed unfixed byoptics microscope at 6, 12, 18 and 24 h p.i. Both TC0668wtand TC0668mutinclusionsible by 12 h p.i. The TC0668 protein (red) is only visible in TC0668wtinclusions at 18and 24 h p.i. Magnifications, x 200.

图 3 qRT-PCR 分析 TC0668wt和 TC0668mut衣原体感染时 tc0668 基因拷贝数，质粒基因 为对照。每个时间点进行三次生物学重复，点代表平均值和标准误差Fig.3 qRT-PCR analysis of tc0668 gene copy number during infection with TC0668wtand TCchlamydial strain, plasmid gene pgp8 was a control. Three biological replicates each time poidone, points represent means and standard errors.
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本文编号：2883753