稳定表达荧光素酶的产酸克雷伯菌在评估不同灭菌方法中的应用

发布时间：2020-11-14 19:13

　　 目的构建稳定表达荧光素酶基因(lux)的产酸克雷伯菌,旨在更直观地观察产酸克雷伯菌(K. oxytoca)在宿主体内的分布以及评估不同杀菌方法的效果。方法扩增p BAV1k-T5-Lux质粒的荧光素酶基因簇(Lux A/B/C/D/E),构建含有Lux A/B/C/D/E基因簇的p BBR1质粒(p BBR1-lux),并获得能够表达荧光素基因基团的大肠埃希菌(E. coli-p BBR1-lux)。将p BBR1-lux质粒电转化至产酸克雷伯菌感受态细胞,经荧光强度鉴定及菌株的3次传代,筛选能够稳定表达lux基因的产酸克雷伯菌(K. oxytoca-p BBR1-lux)。结果连接成功的环状质粒产物命名为p BBR1-lux。与大肠埃希菌对照株相比,含E. coli-p BBR1-lux的Luminesence荧光信号值显著升高[15 345(14 676,18 654) vs. 63(60,82)],差异具有统计学意义(t=21.14、P=0.035)。K.oxytoca-p BBR1-lux的Luminesence荧光信号值[399 303(265 245,617 192)]显著高于产酸克雷伯菌对照菌株[83(63.5,86.75)],差异具有统计学意义(t=7.07、P=0.014)。E. coli-p BBR1-lux和K. oxytoca-p BBR1-lux均能够在Veritas微孔板光度计和小动物成像仪上检测到Luminesence荧光信号。将所得菌株按照1︰10稀释6个梯度,荧光值检测结果显示,Luminesence值随菌落浓度降低而下降。多次传代后p BBR1-lux能够在产酸克雷伯菌中稳定表达荧光素酶,不同理化杀菌方法对产酸克雷伯菌杀菌效果不同,紫外线和84消毒液(10%)是最有效的杀灭产酸克雷伯菌方法。结论本研究获得了可被微孔板光度计和小动物成像仪检测到的稳定表达荧光素酶的K. oxytoca-p BBR1-lux。
【部分图文】：

中华实验和临床感染病杂志(电子版)2020年8月第14卷第4期ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),August2020,Vol.14,No.4·275·注：A：E.coli-pBBR1-lux的荧光值显著高于对照菌株；B：E.coli-pBBR1-lux在小动物活体成像仪上可见荧光。*：差异具有统计学意义（P＜0.05）图2E.coli-pBBR1-lux能够稳定表达荧光素酶注：A：K.oxytoca-pBBR1-lux的荧光值显著高于对照菌株K.oxytoca-Control；B：K.oxytoca-pBBR1-lux在小动物活体成像仪上可见荧光。*：差异具有统计学意义（P＜0.05）图3K.oxytoca-pBBR1-lux稳定表达荧光素酶的Luminesence荧光信号值显著升高[15345（14676，18654）vs.63（60，82）]，差异具有统计学意义（t=21.14、P=0.035）。IVISLuminaLT小动物活体成像仪检测结果显示，E.coli-pBBR1-lux成像仪上可见荧光，见图2。三、K.oxytoca-pBBR1-lux表达荧光素酶功能验证在液体LB培养基中大量扩增E.coli-pBBR1-lux，并提取pBBR1-lux质粒。将质粒电转化至产酸克雷伯菌感受态细胞中。在含有氯霉素的哥伦比亚血平板培养基上筛选氯霉素耐药的阳性菌落。阳性菌落经过传代培养后，使用Veritas微孔板光度计检测其Luminesence值，选取第3代（P3）有Luminesence信号的菌落命名为K.oxytoca-pBBR1-lux；同时，K.oxytoca-pBBR1-lux的Luminesence荧光信号值[399303（265245，617192）]显著高于产酸克雷伯菌对照菌株[83（63.5，86.75）]，差异具有统计学意义（t=7.07、P=0.014），使用IVISLumin

第14卷第4期ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),August2020,Vol.14,No.4·275·注：A：E.coli-pBBR1-lux的荧光值显著高于对照菌株；B：E.coli-pBBR1-lux在小动物活体成像仪上可见荧光。*：差异具有统计学意义（P＜0.05）图2E.coli-pBBR1-lux能够稳定表达荧光素酶注：A：K.oxytoca-pBBR1-lux的荧光值显著高于对照菌株K.oxytoca-Control；B：K.oxytoca-pBBR1-lux在小动物活体成像仪上可见荧光。*：差异具有统计学意义（P＜0.05）图3K.oxytoca-pBBR1-lux稳定表达荧光素酶的Luminesence荧光信号值显著升高[15345（14676，18654）vs.63（60，82）]，差异具有统计学意义（t=21.14、P=0.035）。IVISLuminaLT小动物活体成像仪检测结果显示，E.coli-pBBR1-lux成像仪上可见荧光，见图2。三、K.oxytoca-pBBR1-lux表达荧光素酶功能验证在液体LB培养基中大量扩增E.coli-pBBR1-lux，并提取pBBR1-lux质粒。将质粒电转化至产酸克雷伯菌感受态细胞中。在含有氯霉素的哥伦比亚血平板培养基上筛选氯霉素耐药的阳性菌落。阳性菌落经过传代培养后，使用Veritas微孔板光度计检测其Luminesence值，选取第3代（P3）有Luminesence信号的菌落命名为K.oxytoca-pBBR1-lux；同时，K.oxytoca-pBBR1-lux的Luminesence荧光信号值[399303（265245，617192）]显著高于产酸克雷伯菌对照菌株[83（63.5，86.75）]，差异具有统计学意义（t=7.07、P=0.014），使用IVISLuminaLT小动物活体成像仪检测结果显示，K.oxytoca-pBBR1

·276·中华实验和临床感染病杂志(电子版)2020年8月第14卷第4期ChinJExpClinInfectDis(ElectronicEdition),August2020,Vol.14,No.4度计检测细菌A600值。依据A600=109c.f.u计算细菌浓度[15-16]。将所得菌株按照1︰10稀释6个梯度，在酶标仪上检测荧光值，结果显示Luminesence值随菌落浓度降低而下降，当菌株浓度为106c.f.u和105c.f.u时，其荧光强度分别为（5869±215.9）和（660.2±215.9），见图5。六、不同处理方式对K.oxytoca-pBBR1-lux杀菌效果的验证紫外灯和84消毒液杀菌效果最强（完全杀菌：平板上未见K.oxytoca-pBBR1-lux）。酒精、H2O2和NaOH（0.4%，4%）不能够完全杀灭K.oxytoca-pBBR1-lux（不完全杀菌：平板上可见K.oxytoca-pBBR1-lux），见图6。讨论本研究结果显示，当细菌浓度为103c.f.u/ml时，其荧光强度与阴性对照差异无统计学意义，故该细菌如果用于动物实验时，其在动物体内富集浓度不能低于104c.f.u/ml。产酸克雷伯菌属于革兰阴性肠杆菌，是院内感染和外科手术感染最常见的病原菌之一，产酸克雷伯菌感染与青霉素及其他抗菌药物使用相关[15-17]，研究发现，产酸克雷伯菌能够对碳青霉烯耐药，给临床治疗带来了极大的挑战[18-20]。故研发新的抗菌药物和寻找新的杀菌方法对于临床应对多耐药菌具有重要意义，而目前对于抗菌药物杀菌效果图5不同浓度K.oxytoca-pBBR1-lux的Luminescence荧光强度图6不同理化杀菌方法对K.oxytoca-pBBR1-lux的杀菌效果图4传代至第十代后K.oxytoca-pBBR1-lux稳定表达荧光素酶
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