SB431542对人羊膜上皮细胞上皮间质转化的影响

发布时间：2020-11-16 06:16

　　 目的探讨通过添加TGF-β抑制剂SB431542控制人羊膜上皮细胞的干性、表型和间质特性,为SB431542在预防人羊膜上皮细胞上皮间质转化(EMT)中的作用提供依据。方法使用不同浓度SB431542培养P2代人羊膜上皮细胞,通过细胞的增殖曲线和基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表达的差异,筛选出最适浓度。以不加SB431542的细胞为对照组,以加最适浓度的SB431542为实验组,比较不同代次的对照组和实验组的细胞倍增时间,基因表达水平(CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2),流式检测细胞表面标志物(CD146、CD105、SSEA4)和免疫荧光检测细胞蛋白表达情况(CK8、ACTA2、EpCAM)的差异。结果使用不同浓度SB431542培养P2代人羊膜上皮细胞,5μmol/L SB431542培养条件下的细胞增殖曲线最优,且基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表达最优,最终筛选最适药物浓度为5μmol/LSB431542完成后续实验。在5μmol/L SB431542培养条件下,P7代实验组的细胞倍增时间优于对照组;P7代实验组细胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平,实验组的ACTA2(α-SMA)和Vimentin表达水平明显低于对照组细胞的表达水平;P3和P5代细胞的实验组的间充质标志物CD146、CD105的表达量均比对照组的低,实验组干细胞标志物SSEA4的表达量均比对照组的高;P7代实验组的CK8和EpCAM表达效果强于P7代对照组细胞,且P7代实验组的α-SMA基本不表达。结论 5μmol/LSB431542在人羊膜上皮细胞体外培养7个代次以内可以有效地抑制其上皮间质转化的发生。
【部分图文】：

实验数据（图2）表明，P1～P6人羊膜上皮细胞加药和不加药的细胞倍增时间基本一致。在P7代，加药的细胞倍增时间为43.5 h，不加药的细胞倍增时间为61.4 h。5μmol/L SB431542在7个代次内可维持羊膜上皮细胞的增殖。图2 5μmol/L SB431542对不同代次的人羊膜上皮细胞的倍增时间影响

图1 5μmol/L SB431542为hAECs生长的最佳的浓度（A：每天将CCK8加入不同浓度SB431542培养的细胞中，根据OD450读数绘制生长曲线；B：使用qPCR检测不同浓度SB431542培养的P2 hAECs的生物标志物的表达水平情况；*P<0.05)2.3 5μmol/L SB431542对人羊膜上皮细胞的基因表达水平的影响

使用qPCR检测对照组和实验组P1、P3、P7代人羊膜上皮细胞的基因表达水平情况。使用的Marker为上皮标志物角蛋白8(CK8）和19(CK19）、干细胞标志物OCT4和KLF4、间充质干细胞标志物波形蛋白和ACTA2（α-SMA）。从实验数据（图3）来看，对照组和实验组在CK8、CK19、KLF4、OCT4、波形蛋白和ACTA2（α-SMA）的基因表达水平上都有显著性差异（P<0.05）。且在P7代时，实验组细胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平；实验组细胞的ACTA2（α-SMA）和波形蛋白明显低于对照组的表达水平。2.4 5μmol/L SB431542对人羊膜上皮细胞的表面标志物的影响
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