一种新型靶向Frizzled7抗体的筛选及其人源化设计

发布时间：2020-11-16 09:54

　　 目的:获得一种新型靶向人Frizzled7(Fzd7)蛋白的人源化抗体。方法:首先用重组人Fzd7蛋白(rh Fzd7)免疫BALB/c小鼠,获得鼠源抗Fzd7抗体(SHH002),并用生物膜层干涉技术(biolayer interferometry,BLI)检测SHH002的亲和力;测序获得SHH002可变区序列(V区),通过与Human Germline序列库比对选择人源化设计模板,利用Discoverystudio软件对SHH002进行人源化设计,获得人源化抗Fzd7抗体SHH002-hu,并对SHH002-hu的纯度和亲和力进行验证,最后通过MTT实验初步验证其抗肿瘤活性。结果:杂交瘤筛选技术获得高亲和力(亲和力常数KD 1. 0×10-12mol·L-1)鼠源抗Fzd7抗体SHH002; SHH002 V区序列比对Human Germline序列库,选择同源性最高的IGHV1/IGKV1作为人源化设计模板,保留对抗体结构稳定性起关键作用的鼠源氨基酸,将非关键的位点突变为人源氨基酸,获得人源化程度高达98%的人源化抗体SHH002-hu;分子排阻色谱(SEC-HPLC)检测其纯度 95%,BLI法验证其KD 1. 0×10-12mol·L-1,MTT实验表明SHH002-hu可有效抑制三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)细胞的体外增殖。结论:本实验获得了高度人源化且高亲和力的靶向Fzd7抗体SHH002-hu,为多种恶性肿瘤提供一种全新的靶向治疗候选方案。
【部分图文】：

有限稀释法经3～4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100%时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，挑选效价最高的4株单克隆(1#,2#,3#和11#)扩大培养，并腹腔注射小鼠，7～10 d采集腹水。Western Blot检测4株腹水与抗原的结合，图1显示4株腹水均检测到目标条带，其中腹水1#,2#,3#效果较好。箭头所指条带为目的条带所在位置，下部条带疑为蛋白降解结合条带(蛋白立春红染色后在该位置有明显条带)。1.2 SDS-PAGE电泳初步鉴定抗体

SDS-PAGE电泳初步鉴定纯化后抗体，如图2所示。非还原条件下在150 kDa处出现目的条带，主带明显;还原条件下在50和25 k Da处分别出现目的条带(重链和轻链)，说明1#,2#,3#抗体重轻链表达正确且装配完全。1.3鼠源抗Fzd7抗体的免疫球蛋白亚型鉴定

间接ELISA测得的抗体亲和力分别为:1#抗体:(4.06±0.24)×10-11mol·L-1(n=3);2#抗体:(9.74±0.64)×10-11mol·L-1(n=3);3#抗体:(7.59±0.58)×10-11mol·L-1(n=3)。ELISA法测得的反应曲线如图3A～C所示。挑选亲和力最高的1#抗体(即SHH002)，用BLI法进一步验证其亲和力，实验结果显示SHH002与rhFzd7的结合常数(ka)=(2.85±0.17)×104mol-1·L·s-1，解离常数(kd)<1×10-7s-1,KD<1×10-12mol·L-1(n=3)，结合解离动力学过程拟合曲线图如图3D所示。对比间接ELISA法，BLI法测得的SHH002亲和力更高;分析其原因可能为BLI法中是将抗体偶联在芯片上去捕捉流动相中的抗原，相比间接ELISA法中将抗原包被在酶标板上去捕捉抗体，更有效地规避了抗体抗原结合的空间位阻。以上结果说明我们已经成功获得稳定表达抗Fzd7抗体的杂交瘤细胞株，并得到具有高亲和力的鼠源抗Fzd7抗体SHH002。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 杨滨;杨向民;陈志南;;基于表面重塑方法的抗体HAb18可变区人源化设计[J];科学技术与工程;2007年14期

2 程联胜,邢毅,刘兢;基于公共信息资源的p185抗体人源化设计[J];中国科学技术大学学报;2002年05期

3 葛良鹏;丁宁;兰国成;邹贤刚;刘作华;;治疗性抗体的研究现状与未来[J];中国生物工程杂志;2013年09期

4 王亭亭;;中科院微生物所研发获得寨卡病毒人源治疗性抗体[J];首都食品与医药;2017年03期

5 梁琍;;治疗性抗体的研究进展[J];生物技术通讯;2006年05期

6 黄家强;新一代治疗用抗体——改型抗体[J];国外医学(分子生物学分册);1997年02期

7 张文;刘红军;胡志军;高琰;高志涛;王辉;;兔抗凋亡蛋白酶活化因子-1多克隆抗体的制备、纯化与鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年01期

8 邢爽;;抗感染抗体[J];国外医学(药学分册);2007年03期

9 吴文冰;兰小鹏;;抗SSA/Ro抗体研究的新进展[J];江西医学检验;2006年03期

10 吴庆军,唐福林,甘晓丹,史艳萍,邓学新,宋琴芳;Ku抗体的检测及其临床意义[J];中华内科杂志;2000年08期

相关博士学位论文 前6条

1 张顶;DEC-205靶向抗体的制备及其人源化改造[D];北京协和医学院;2013年

2 耿树生;抗CD20抗体的改造及其生物活性研究[D];河北大学;2007年

3 陈长春;抗BONTS抗体的制备、筛选及抗体间协同保护机制的研究[D];上海交通大学;2012年

4 王辉丽;抗体修饰肿瘤细胞疫苗实验研究[D];中国协和医科大学;2008年

5 杨跃梅;靶向HER2抗体稳定性改造及功能优化研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

6 杨彬;工程化的人抗人IgE抗体的制备[D];复旦大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 杨滨;HAb18G/CD147及其单抗的分子模建对接和抗体人源化设计的研究[D];第四军医大学;2007年

2 张天成;抗蓖麻毒素对可变区抗体的构建和机制研究[D];第二军医大学;2012年

3 刘学博;山东省不同地区不同人群三种流感病毒血凝素抗体水平调查[D];山东农业大学;2015年

4 叶伟亮;新型抗EGFR抗体的设计及功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

5 王星懿;采用六西格玛管理方法研究动物细胞生产抗体过程产量的稳定性[D];华东理工大学;2015年

6 孙梦梅;抗EGFR人源化抗体的构建、表达、纯化和功能分析[D];安徽大学;2011年

7 燕格格;Punctin-2多克隆抗体的制备与鉴定[D];湖南大学;2019年

8 吴东明;14-3-3zeta蛋白多克隆抗体的制备与鉴定[D];安徽大学;2007年

9 孙琪琛;纳米抗体用于亲和纯化传统抗体的研究[D];东南大学;2016年

10 陈晓明;抗人巨细胞病毒gBn1抗体的制备及鉴定[D];浙江大学;2008年

本文编号：2885994