机体可通过诱导天然免疫反应和适应性免疫反应杀灭和清除入侵的病原体以维持机体的稳定与健康,但是,一旦其活化调控异常则会引发诸多炎症性疾病。巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞以及中性粒细胞等天然免疫细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PPRs)识别病原体的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信号通路,诱导产生炎性因子、招募和激活更多的免疫细胞以吞噬和清除病原体。PPRs包括Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)、NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)和胞浆中识别病毒DNA的受体等。其中,TLR4是特异性识别革兰氏阴性菌表面脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的模式识别受体。TLR4结合LPS之后,激活下游的NF-κB(nuclear factor kappa light-chain-enhancer of activated B cells)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信号通路,诱导产生炎性细胞因子。此外,TLR4识别配体之后还会被内吞至内体,激活IRF3(interferon regulatory factor 3)等信号通路诱导干扰素产生,进一步放大炎症反应。另外,吞噬细胞通过内吞作用将病原体吞噬,再通过细胞内囊泡将病原体先后运送至内体和溶酶体,在溶酶体的酸性环境中,病原体被溶酶体水解酶降解,其降解产物可以形成抗原多肽递呈至组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC),在抗原提呈细胞共刺激因子的作用下激活CD4~+和CD8~+T细胞,激活适应性免疫反应。小窝(caveolae)是细胞膜上一种特殊的脂筏,其在电镜下形态为细胞膜的球状内陷。小窝具有重要的生理功能,目前发现,小窝能够介导细胞吞噬病原体、调节细胞内脂质平衡、参与细胞内信号转导、缓冲细胞膜受到的机械力,甚至还参与癌症的发生与发展。小窝的组成成分复杂,主要包括蛋白和脂质。组成小窝的蛋白主要为小窝蛋白(caveolins)家族和小窝相关蛋白(caveolae associated proteins,Cavins)家族成员。Caveolins家族有三个成员,分别是caveolin-1(Cav1),caveolin-2(Cav2)和caveolin-3(Cav3)。其中,Cav1是形成小窝的必要因素,除参与小窝形成外,Cav1在信号转导、脂质代谢以及肿瘤发生等发面发挥着重要的作用。Cav2不是组成小窝的必要蛋白,但Cav2可以协同Cav1促进小窝的形成。鉴于Cav1具有的生物学功能及其在细胞吞噬中的重要作用,为了进一步研究细胞吞噬和清除病原体的关键调节因子,我们通过质谱(MS)技术去发现和鉴定Cav1的相互作用蛋白。在质谱结果中,我们筛选出与Cav1结合的蛋白质分子LAPF(lysosome-associated and apoptosis-inducing protein containing PH and FYVE domains,or PLEKHF1)。LAPF是由我们实验室2005年通过人骨髓基质细胞cDNA文库大规模随机测序首先发现并克隆的分子。我们先前的工作发现,LAPF通过招募磷酸化P53蛋白至溶酶体并破坏溶酶体稳定性,促进TNFα诱导的半胱天冬酶(caspase)非依赖的细胞凋亡。但LAPF在天然免疫,尤其是其在细菌吞噬和清除中的功能还没有相关报道,值得进一步研究。为了研究LAPF在细胞吞噬和清除细菌中的作用,我们构建了髓系细胞特异性敲除Lapf基因的Lapf ~(fl/fl)-LysMcre(Lapf~(-/-))小鼠,并以同窝的Lapf ~(fl/+)-LysMcre(Lapf~(+/-))小鼠作为对照组。Lapf基因缺陷的巨噬细胞吞噬碘化丙啶(propidium iodide,PI)标记的灭活大肠杆菌(E.coli)的数量显著少于对照组。Lapf~(-/-)巨噬细胞吞噬E.coli、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、酵母聚糖(Zymosan)和乳胶珠(Latex beads)的能力也明显减弱,说明Lapf基因缺陷影响巨噬细胞的吞噬能力,提示LAPF促进巨噬细胞的吞噬能力。接下来我们分析Lapf基因缺陷是否影响巨噬细胞的杀菌能力。我们用E.coli分别感染Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬细胞一定时间,记录巨噬细胞吞噬细菌的数量,再过一段时间后观察巨噬细胞内的活菌数占原吞噬数的百分比。我们发现Lapf~(-/-)的巨噬细胞内的活菌数百分比显著高于Lapf~(+/-)的巨噬细胞,说明Lapf基因缺陷降低了巨噬细胞清除细胞内细菌的效率,提示LAPF促进巨噬细胞杀灭细胞内细菌的能力。以上体外实验的结果说明了LAPF在巨噬细胞吞噬和清除细菌过程中发挥着重要的作用,那么其在体内细菌感染过程中效应如何呢?我们用E.coli分别感染Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)小鼠,发现Lapf~(-/-)小鼠在细菌感染之后更容易死亡。进一步研究发现,Lapf~(-/-)小鼠脾脏和肝脏的荷菌量显著高于对照小鼠,血清中TNFα、IL-6和IFNβ等细胞因子水平显著低于对照小鼠。组织学检测显示Lapf~(-/-)小鼠肺部炎症细胞浸润程度明显低于Lapf~(+/-)小鼠。这些结果说明,巨噬细胞Lapf缺陷的小鼠在细菌感染过程中清除体内细菌的能力减弱,炎症反应减弱,且更容易死亡,提示LAPF促进小鼠抵抗细菌感染的能力。Lapf~(-/-)小鼠在细菌感染时体内炎症反应减轻,是由于巨噬细胞吞噬细菌减少不能有效激活体内的炎症反应么?LAPF在TLR4介导的炎症反应中效应如何呢?我们将Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)小鼠腹腔注射LPS,发现Lapf~(-/-)小鼠血清中的炎性因子水平显著低于对照小鼠。我们用LPS刺激Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬细胞,发现Lapf~(-/-)巨噬细胞产生的TNFα、IL-6和IFNβ等细胞因子显著低于对照细胞。通过Western blot检测Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬细胞TLR4介导的NK-κB和MAPK等信号通路的激活,我们发现Lapf~(-/-)巨噬细胞的TBK1、IRF3、IKKα/β、P65、JNK、ERK1/2和P38等信号分子的磷酸化水平均显著低于对照组,而过表达LAPF的RAW264.7细胞中,LPS诱导的IRF3和P65的活化增加,说明LAPF促进TLR4介导的炎症反应。我们继续检测了LPS刺激后Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬细胞表面的TLR4水平,发现在Lapf~(-/-)巨噬细胞中,LPS诱导的TLR4内吞减少,说明Lapf缺陷通过阻碍TLR4内吞减弱LPS诱导的炎症反应,提示LAPF通过促进TLR4内吞从而促进LPS诱导的炎症反应。LAPF是如何调节巨噬细胞吞噬细菌的呢?我们发现巨噬细胞通过caveolae介导的内吞作用吞噬E.coli,而LAPF分别与Cav1和Cav2共定位且相互作用。进一步研究发现,特异性抑制小窝介导的内吞阻碍了LAPF介导的巨噬细胞吞噬E.coli。这些结果说明LAPF通过caveolae介导的内吞促进细胞吞噬细菌。我们进一步研究LAPF通过caveolae促进细胞吞噬细菌的分子机制。通过免疫荧光实验,我们确定LAPF定位于早期溶酶体。我们用Western blot实验检测了Lapf的缺陷后Cav1或Cav2的表达量,发现LAPF并不影响Cav1和Cav2的表达。那么LAPF是否影响了caveolae形成呢?我们检测LAPF是否可以促进Cav1和Cav2的聚集,发现LAPF既可以促进Cav1的寡聚化,也可以促进Cav1和Cav2的异聚化。这些结果说明LAPF通过促进caveolae的Cav1和Cav2的聚集,促进caveolae的形成,进而促进细胞吞噬E.coli。最后,我们研究了LAPF的翻译后修饰及活化机制。通过免疫共沉淀实验我们发现,LAPF可以被Src磷酸化。我们构建了一系列LAPF的酪氨酸残基位点突变质粒,发现LAPF分子内的第208位或268位酪氨酸突变后,LAPF的磷酸化明显减少。LAPF-Y208F/Y268F与Src和Cav1相互作用明显减弱,促进Cav1与Cav2聚集的效应也明显减弱。我们检测过表达LAPF突变体的细胞吞噬细菌的能力。过表达LAPF-Y268F不能促进A549细胞对细菌的吞噬,且过表达CA-Src/LAPF-WT的A549吞噬细菌的数量显著高于过表达CA-Src/LAPF-Y268F的细胞。这些结果说明,磷酸化LAPF在细胞吞噬细菌的过程中发挥了关键作用。由此我们推测,LAPF被Src磷酸化后,增加LAPF-Src-Cav1复合体形成,促进caveolins聚集,进而增加caveolae的形成,以进一步提高细胞吞噬细菌的能力。我们发现在E.coli感染时,巨噬细胞内会形成LAPF-Src-Cav1复合体,而在Lapf基因缺陷的巨噬细胞内,Src与Cav1的相互作用明显减弱,这些结果表明,磷酸化LAPF对LAPF-Src-Cav1复合体形成以及Src与Cav1相互作用十分重要。通过Western blot分析,我们发现Src抑制剂达沙替尼(Dasatinib)抑制LAPF-Src-Cav1复合体形成。进一步研究发现,Dasatinib预处理的Lapf~(+/-)巨噬细胞吞噬的细菌数量显著减少,而Dasatinib预处理的Lapf~(-/-)巨噬细胞吞噬细菌的数量与对照组(DMSO处理)没有明显差异,说明Dasatinib抑制细胞吞噬细菌。在体内实验中,我们发现Dasatinib预处理的小鼠在细菌感染时更容易死亡。这些结果说明Dasatinib抑制细胞吞噬细菌,降低了小鼠的抗感染能力,也进一步验证了抑制LAPF-Src-Cav1复合体形成可以抑制细胞对细菌的吞噬。综上所述,在本研究中我们发现了LAPF促进细胞吞噬和清除细菌的关键作用,揭示了LAPF促进宿主抵抗细菌感染的新机制,为抗感染药物的研发提供了新的潜在靶点。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：
带 Flag、myc 和 V5 标签抗体的琼脂糖亲和凝胶珠购于以及荧光标记的 Lds 购于 Sigma-Aldrich 公司。Dasatinib 购于 Selleck 公司。蛋白缓冲液on-X-100 和 DMSO 购于上海生工生物工程股份有限公司。快速银染试剂盒、光实验所用的碘化丙啶（PI）以及 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dihydrochloridPI）购于碧云天公司。.4 分子克隆载体和菌株分子克隆实验中所用的空载体 pcDNA3.1（-）B 购于 Invitrogen 公司，经本李楠教授改造，在其 C-端加入 Flag、myc、HA 或 V5 等标签序列，作为真质粒载体。以带 Flag 标签的表达载体为例，其质粒图谱如下（图 2-1）。分子验所用KOD plus试剂盒购于TOYOBO公司，同源重组试剂盒购于诺唯赞公性内切酶 EcoR I、BamH I、Hind III、DNA 连接酶 Solution I 以及构建点突所用的 Dpn I 酶等均购于 Takara 公司。转化用感受态 E.coli DH5α 菌株购于公司。DNA 胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒均购于 AXYGEN 公司。提试剂盒购于 Invitrogen 公司。
图 2-2 Lapf 基因敲除策略Figure 2. Lapf gene knockout strategyB6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J （LysMcre） 小鼠购于 Jackson Lab 公司，是髓系细表达 cre 酶的小鼠。将适龄的 LyzMcre 小鼠与 Lapffl/fl或 Lapffl/+小鼠杂交后得到件性敲除髓系细胞中 Lapf 基因的 Lapffl/fl-LysMcre（Lapf-/-）小鼠和同窝对照 Lafl/+- LysMcre （Lapf+/-）小鼠。2.2.2 条件性基因敲除小鼠的鉴定将待鉴定小鼠尾巴末端剪下约 3mm，放入 1.5ml 离心管中，加入组织裂解液蛋白酶 K 后，将其放入 55°C 水浴锅中过夜。使用细胞/组织基因组 DNA 提取试盒（购于上海捷瑞生物技术有限公司）提取鼠尾基因组 DNA，再进行 PCR 鉴定PCR 鉴定所用 DNA 聚合酶 Extaq 购于 Takara 公司，鉴定引物由上海生工生物工股份有限公司合成。小鼠 PCR 鉴定引物序列如下：
rd/ Reverse（10μM） 各 0.2μlNA 2μl（<10ng）5.1μl：reture Time2min20s20s40 个循环1min10minHold在 1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离。ox 纯合子（Lapffl/fl）在 369bp 处有明条带，Flox 杂合子（Lapffl/+）在 369
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