基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的建立及应用
本文关键词：基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：机体氧化应激产生的过量自由基,可直接或间接损伤DNA、蛋白质和脂质,使机体的氧化与抗氧化平衡系统被打破,利用外源性抗氧化活性物质对抗体内过量自由基是医学领域的主要手段。传统的抗氧化活性评价方法,因其各自的技术缺陷,严重制约着抗氧化活性物质的发现。因此,亟需建立一种新的抗氧化活性评价方法。细胞代谢组学是系统生物学的一个分支,因其灵敏度高、选择性好、快速、准确性高、可控性强等多种优点,可发展为一种新的抗氧化活性评价方法。与化学评价方法相比较,基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法以细胞为载体,未脱离生物体本身,更接近于生物体氧化反应过程;与细胞学评价方法相比较,基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法运用细胞代谢组学研究方法,可全面反映细胞内代谢物信息。本研究采用细胞代谢组学研究方法,以HepG2细胞为研究对象,基于HPLC-DAD-MS技术平台,通过对细胞代谢物的分析,结合多种模式识别技术,获取与抗氧化活性相关的代谢物靶标,构建基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法,并应用该方法评价锁阳提取物。主要研究内容如下:(1)细胞样品前处理及HPLC分析方法的研究。为最大限度地提取代谢物并取得可靠的分析结果,对细胞样品前处理及HPLC分析方法进行了系统优化。细胞代谢物用㧟20°C预冷的60%甲醇淬灭、超声波破碎、60%甲醇提取进样分析。HPLC色谱条件为:流速1.0 mL/min;柱温30°C;色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为1.93 g/L醋酸铵(pH=4.81)和乙腈;溶剂洗脱梯度为0.5-5%乙腈(0-10 min)、5-95%乙腈(10-60 min);检测波长为254 nm。(2)基于细胞代谢组学的氧化应激生物标记物的发现。通过MTT实验选择5mg/L H2O2作用4 h,100 mg/L VE作用24 h,250 mg/L GSH作用24 h建立氧化应激模型。检测细胞内ROS水平及酶活性验证氧化应激模型。对细胞代谢物进行HPLC分析,从典型的HPLC-DAD谱图中选取28个共有峰进行模式识别分析,借助于OPLS-DA模型的S-plot图及VIP值筛选出11种潜在的氧化应激生物标记物。同时,采用LC-MS联用技术得到潜在生物标记物的精确相对分子质量,通过细胞代谢物与对照品的紫外光谱图、保留时间并结合加标法对色谱峰定性,其中p1、p2、p3及p9分别鉴定为苹果酸、VC、GSH及色氨酸。(3)基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的建立。在OPLS-DA模型基础上,建立了基于细胞代谢组学的抗氧化活性定性评价方法。以VE或GSH的CMAA unit值为标准,定量评价物质的抗氧化活性,建立了基于细胞代谢组学的抗氧化活性定量评价方法。(4)基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的应用。根据前期建立的细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法评价锁阳提取物,并运用化学评价方法及细胞学评价方法进行验证。结果显示,建立的基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法是可靠的,且结果与传统的抗氧化活性评价方法的结果一致。多种评价方法结果均显示,锁阳多糖与锁阳黄酮具有一定的抗氧化活性,且锁阳黄酮抗氧化活性较强。
【关键词】：细胞代谢组学 抗氧化活性 评价方法 生物标记物 样品前处理 模式识别 锁阳
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 中文摘要3-5
- Abstract5-11
- 第一章 抗氧化活性评价方法及细胞代谢组学研究进展11-19
- 1 抗氧化活性评价方法研究进展11-14
- 1.1 体外评价方法11-13
- 1.2 体内评价方法13-14
- 1.3 小结14
- 2 细胞代谢组学研究进展14-19
- 2.1 细胞代谢组学的发展历程14-15
- 2.2 细胞代谢组学的研究方法15-16
- 2.3 细胞代谢组学的应用16-18
- 2.4 小结18-19
- 第二章 细胞样品前处理及HPLC分析方法的研究19-30
- 1 仪器，材料与试剂19-20
- 1.1 仪器19-20
- 1.2 试剂20
- 1.3 材料20
- 2 实验方法20-22
- 2.1 细胞样品前处理方法的研究20-21
- 2.2 HPLC分析方法的研究21-22
- 3 结果与分析22-29
- 3.1 细胞样品前处理方法的研究22-25
- 3.2 HPLC分析方法的研究25-28
- 3.3 方法学验证28-29
- 4 结论29-30
- 第三章 基于细胞代谢组学的氧化应激生物标记物的发现30-43
- 1 仪器，材料与试剂30-31
- 1.1 仪器30-31
- 1.2 试剂31
- 1.3 材料31
- 2 实验方法31-33
- 2.1 氧化应激细胞模型的构建31-32
- 2.2 细胞样品前处理32
- 2.3 色谱分析32-33
- 3 数据处理33
- 4 结果与分析33-42
- 4.1 氧化应激细胞模型的构建33-35
- 4.2 细胞代谢物HPLC谱图35-36
- 4.3 潜在氧化应激生物标记物的发现36-42
- 5 结论42-43
- 第四章 基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的建立43-50
- 1 仪器，材料与试剂43
- 1.1 仪器43
- 1.2 试剂43
- 1.3 材料43
- 2 实验方法43-44
- 2.1 氧化应激细胞模型的构建43-44
- 2.2 样品前处理44
- 2.3 色谱分析44
- 3 数据处理44
- 4 结果与分析44-49
- 4.1 基于细胞代谢组学的抗氧化活性定性评价方法的建立44-47
- 4.2 基于细胞代谢组学的抗氧化活性定量评价方法的建立47-49
- 5 结论49-50
- 第五章 基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的应用50-59
- 1 仪器，材料与试剂50-51
- 1.1 仪器50
- 1.2 试剂50-51
- 1.3 材料51
- 2 实验方法51-52
- 2.1 基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法评价锁阳提取物51
- 2.2 传统的体外抗氧化活性评价方法评价锁阳提取物51-52
- 3 统计学分析52
- 4 结果与分析52-58
- 4.1 基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法评价锁阳提取物52-55
- 4.2 传统的体外抗氧化活性评价方法评价锁阳提取物55-58
- 5 结论58-59
- 参考文献59-64
- 研究生阶段的研究成果64-65
- 致谢65
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