白念珠菌CaPDE2基因的敲除与功能研究
发布时间：2020-12-07 14:03
构建白念珠菌CaPDE2基因缺失株,研究其功能.通过PCR扩增构建含有CaPDE2基因同源臂100 bp的SAT1-flipper敲除盒,用于敲除CaPDE2第一等位基因;然后通过构建CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒（同源臂700～1 000 bp）,敲除CaPDE2第二等位基因.将CaPDE2基因缺失株依次培养在YPD+25μg/mL ClonNAT、YPD+0.1%5-FOA培养基中,以去掉SAT1和URA3基因筛选标记;通过CaPDE2基因缺失株的表型试验初步检测了CaPDE2基因的功能.结果表明:联合采用URA3和SAT1筛选标记完成CaPDE2双等位基因的敲除,得到了CaPDE2基因缺失株,并去掉SAT1和URA3基因标记,其基因型为Capde2::FRT/Capde2::hisG. Ca PDE2基因缺失株对酮康唑、氟康唑、十二烷基硫酸钠及42℃均敏感.因此,CaPDE2参与调节白念珠菌抗真菌药物、细胞膜压力及高温的耐受性.
【文章来源】：淮北师范大学学报(自然科学版). 2020年02期 第49-54页
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
CaPDE2基因的URA3-blaster敲除质粒pDY2的SacI、HindⅢ双酶切验证
白念珠菌是二倍体，对白念珠菌基因的敲除必须敲除目的基因的两个等位基因.本研究出发菌株CAI4是尿苷营养缺陷型菌株[10]，而且对诺尔斯菌素敏感[11].白念珠菌CaPDE2编码的磷酸二酯酶2蛋白，是Ras/cAMP/PKA通路中的重要成员，该酶催化c AMP水解成5′-AMP而降低胞内cAMP浓度，以维持胞内适当的cAMP浓度.应用诺尔斯菌素抗性基因标记SAT1敲除CaPDE2第一等位基因.以质粒pSFS2为模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以CAI4基因组作为模板，PCR扩增出大小约为4.3 kb的CaPDE2的SAT1-flipper敲除盒（图3）.将该敲除盒转化至CAI4中，涂布于200μg×mL-1ClonNAT的YPD平板，30℃培养48 h，挑取ClonNAT抗性菌株纯化，获得敲除CaPDE2第一等位基因的菌株，其基因型是Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2.接下来，将构建好的含有CaPDE2的URA3-blaster敲除盒的质粒pDY2，用SacI和HindⅢ双酶切，获得5.7 kb带有URA3筛选标记的CaPDE2敲除盒（图2）.将此敲除盒转化至菌株Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2中，涂布在SD-URA+200μg/mL ClonNAT平板上，30℃培养48～72 h，挑取阳性转化子并验证，获得敲除CaPDE2第二等位基因菌株.之后用YPD+25μg/mL ClonNAT平板挤掉SAT1抗性基因，进一步用YPD+0.1%5-FOA平板去除URA3基因，最终获得CaPDE2基因缺失株DY-CA1，其基因型为Capde2::FRT/Capde2::hisG（图4,5）.如图5所示，用引物PDE2-UP-CHECK/DOW-CHECK：以CAI4基因组为模板，扩增出2.2 kb的片段（包含CaPDE2基因全长ORF序列及其一部分启动子和终止子序列）；以CaPDE2基因缺失株的基因组为模板，扩增出0.85 kb和1.7 kb（包含hisG序列及CaPDE2基因的一部分启动子和终止子序列）的2个片段.用引物PDE2-ORF-UP/DOWN：以CAI4基因组为模板，扩增出0.55 kb的片段（CaPDE2基因ORF的一部分序列）；以CaPDE2缺失株的基因组为模板，未扩增出目标条带，表明CaPDE2的2个等位基因都已被敲除.图4 联合应用尿苷合成基因标记URA3和诺尔斯菌素抗性基因标记SAT1敲除CaPDE2双等位基因示意图
联合应用尿苷合成基因标记URA3和诺尔斯菌素抗性基因标记SAT1敲除CaPDE2双等位基因示意图
【参考文献】：
期刊论文
[1]分泌型蛋白介导白念珠菌与宿主相互作用分子机制的研究进展[J]. 王园园,陈昌斌. 菌物学报. 2018(10)
[2]白念珠菌生物被膜形成的遗传调控机制[J]. 郭东东,岳慧珍,魏羽佳,黄广华. 生物工程学报. 2017(09)
[3]白色念珠菌生物被膜研究进展[J]. 李瑞莲,王倬,杜昱光. 微生物学报. 2017(08)
本文编号：2903385
【文章来源】：淮北师范大学学报(自然科学版). 2020年02期 第49-54页
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
CaPDE2基因的URA3-blaster敲除质粒pDY2的SacI、HindⅢ双酶切验证
白念珠菌是二倍体，对白念珠菌基因的敲除必须敲除目的基因的两个等位基因.本研究出发菌株CAI4是尿苷营养缺陷型菌株[10]，而且对诺尔斯菌素敏感[11].白念珠菌CaPDE2编码的磷酸二酯酶2蛋白，是Ras/cAMP/PKA通路中的重要成员，该酶催化c AMP水解成5′-AMP而降低胞内cAMP浓度，以维持胞内适当的cAMP浓度.应用诺尔斯菌素抗性基因标记SAT1敲除CaPDE2第一等位基因.以质粒pSFS2为模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以CAI4基因组作为模板，PCR扩增出大小约为4.3 kb的CaPDE2的SAT1-flipper敲除盒（图3）.将该敲除盒转化至CAI4中，涂布于200μg×mL-1ClonNAT的YPD平板，30℃培养48 h，挑取ClonNAT抗性菌株纯化，获得敲除CaPDE2第一等位基因的菌株，其基因型是Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2.接下来，将构建好的含有CaPDE2的URA3-blaster敲除盒的质粒pDY2，用SacI和HindⅢ双酶切，获得5.7 kb带有URA3筛选标记的CaPDE2敲除盒（图2）.将此敲除盒转化至菌株Capde2::SAT1-flipper/CaPDE2中，涂布在SD-URA+200μg/mL ClonNAT平板上，30℃培养48～72 h，挑取阳性转化子并验证，获得敲除CaPDE2第二等位基因菌株.之后用YPD+25μg/mL ClonNAT平板挤掉SAT1抗性基因，进一步用YPD+0.1%5-FOA平板去除URA3基因，最终获得CaPDE2基因缺失株DY-CA1，其基因型为Capde2::FRT/Capde2::hisG（图4,5）.如图5所示，用引物PDE2-UP-CHECK/DOW-CHECK：以CAI4基因组为模板，扩增出2.2 kb的片段（包含CaPDE2基因全长ORF序列及其一部分启动子和终止子序列）；以CaPDE2基因缺失株的基因组为模板，扩增出0.85 kb和1.7 kb（包含hisG序列及CaPDE2基因的一部分启动子和终止子序列）的2个片段.用引物PDE2-ORF-UP/DOWN：以CAI4基因组为模板，扩增出0.55 kb的片段（CaPDE2基因ORF的一部分序列）；以CaPDE2缺失株的基因组为模板，未扩增出目标条带，表明CaPDE2的2个等位基因都已被敲除.图4 联合应用尿苷合成基因标记URA3和诺尔斯菌素抗性基因标记SAT1敲除CaPDE2双等位基因示意图
联合应用尿苷合成基因标记URA3和诺尔斯菌素抗性基因标记SAT1敲除CaPDE2双等位基因示意图
【参考文献】：
期刊论文
[1]分泌型蛋白介导白念珠菌与宿主相互作用分子机制的研究进展[J]. 王园园,陈昌斌. 菌物学报. 2018(10)
[2]白念珠菌生物被膜形成的遗传调控机制[J]. 郭东东,岳慧珍,魏羽佳,黄广华. 生物工程学报. 2017(09)
[3]白色念珠菌生物被膜研究进展[J]. 李瑞莲,王倬,杜昱光. 微生物学报. 2017(08)
本文编号：2903385
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