抑制素基因敲除小鼠模型的构建及表型初步分析
发布时间：2020-12-13 09:12
目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9）]基因编辑技术构建抑制素基因敲除小鼠模型,并对其表型进行初步分析。方法根据抑制素α亚基的第一外显子碱基序列,设计单链向导RNA（single guide RNA,sgRNA）识别序列,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA后,将sgRNA/Cas9 mRNA显微注射入C57BL/6J小鼠的受精卵,通过PCR和基因测序法检测新生小鼠抑制素α亚基的基因碱基突变情况。选取F2代基因敲除纯合子的雄鼠和雌鼠,分别取雄鼠睾丸和雌鼠卵巢进行观察,并进行石蜡切片和HE染色分析。结果共获得了12只F0代抑制素基因敲除小鼠,选取8号雄鼠与C57BL/6J雌鼠回交,得到F1代小鼠,再相互交配得到F2代小鼠。F2代小鼠各基因型比例符合孟德尔定律,基因敲除小鼠不存在胚胎致死现象。F2代纯合子小鼠睾丸和卵巢发生癌变且无法生育...
【文章来源】：实验动物与比较医学. 2020年04期
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
抑制素基因敲除靶向sgRNA的设计
Aug.2020,40(4)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine309M是DNAMarker，1～12是12只抑制素基因敲除后的F0代小鼠。NC是野生型小鼠C57BL/6J，作为对照。图212只F0代小鼠抑制素基因的PCR后电泳结果Figure2ElectrophoreticresultsofinhibingeneinF0miceafterPCRM123456789101112NC代杂合子小鼠，然后F1代杂合子小鼠自交后产生F2代小鼠，抑制素基因鉴定结果见图3A。统计173只F2代野生型、杂合子和基因敲除纯合子3种基因型小鼠的存活个体数量，分别为45、93和35只，占全部F2代小鼠的26.0%、53.7%和20.2%，约为1∶2∶1，符合孟德尔分离定律，说明抑制素基因敲除小鼠不存在胚胎致死表型。F2代野生型、杂合子和基因敲除纯合子3种基因型小鼠于90日龄的平均体质量比较见图3B，与野生型小鼠相比，杂合子小鼠体质量无明显差异（P＞0.05），而抑制素基因敲除纯合子小鼠的体质量明显减轻（P＜0.05）。2.4抑制素基因敲除小鼠的生殖器官大体观察将F2代抑制素基因敲除雄鼠与雌鼠交配，结果不育。将抑制素α基因敲除雌鼠与C57BL/6J雄鼠交配，仍然不育。观察发现，F2代及后续子代中抑制素α基因敲除雄鼠分笼饲养后，肉眼可见睾丸会逐渐增大。将抑制素基因敲除雄鼠和雌鼠解剖后观察其生殖系统，发现雄鼠的生殖系统发育异常，睾丸变大，颜色发黑，内有血液，附睾萎缩或被吸收入睾丸组织（图4A）；雌鼠的生殖系统同样发育异常，卵巢变大，颜色发黑，输卵管已萎缩或被吸收入卵巢组织，子宫粗大，内部充满液体（图4B）。表1F0代小鼠抑制素基因的TA克隆测序结果Table1TAcloningandgenesequencingresultsofinhibingeneinF0mice小鼠编号抑制素基因敲除区域长度/bp判定178910CCCGAACTTGTCCGGGAG-GGACCTCTGAACC
310实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineAug.2020,40(4)ABA为雄鼠睾丸组织，B为雌鼠卵巢；KO、HET和WT分别代表F2代小鼠的基因敲除纯合子、杂合子和野生型3种基因型。图4抑制素基因敲除小鼠的生殖器官观察Figure4Reproductiveorgansofinhibingeneknockoutmice(A,malemousetestis;B,femalemouseovary)体质量/gNC为C57BL/6J小鼠对照。KO、HET和WT分别代表F2代小鼠的基因敲除纯合子、杂合子和野生型3种基因型。**与野生型小鼠相比，P＜0.05。图3F2代小鼠的抑制素α基因PCR鉴定（A）和体质量比较（B）Figure3ElectrophoreticresultsofPCRproductsofinhibinαgene(A)andbodyweightofF2mice(B)B3种不同基因型小鼠OHETKWT3536373839404142434445464748495051NCA小鼠编号5253545556575859606162636465666768NC小鼠编号6970717273747576777879808182838485NC小鼠编号
【参考文献】：
期刊论文
[1]抑制素基因免疫诱导单胎绵羊孪生的研究[J]. 张德坤,杨利国,张红琳,王文,乌娜尔汗,纪平,古武昌. 中国农业大学学报. 2004(04)
本文编号：2914304
【文章来源】：实验动物与比较医学. 2020年04期
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
抑制素基因敲除靶向sgRNA的设计
Aug.2020,40(4)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine309M是DNAMarker，1～12是12只抑制素基因敲除后的F0代小鼠。NC是野生型小鼠C57BL/6J，作为对照。图212只F0代小鼠抑制素基因的PCR后电泳结果Figure2ElectrophoreticresultsofinhibingeneinF0miceafterPCRM123456789101112NC代杂合子小鼠，然后F1代杂合子小鼠自交后产生F2代小鼠，抑制素基因鉴定结果见图3A。统计173只F2代野生型、杂合子和基因敲除纯合子3种基因型小鼠的存活个体数量，分别为45、93和35只，占全部F2代小鼠的26.0%、53.7%和20.2%，约为1∶2∶1，符合孟德尔分离定律，说明抑制素基因敲除小鼠不存在胚胎致死表型。F2代野生型、杂合子和基因敲除纯合子3种基因型小鼠于90日龄的平均体质量比较见图3B，与野生型小鼠相比，杂合子小鼠体质量无明显差异（P＞0.05），而抑制素基因敲除纯合子小鼠的体质量明显减轻（P＜0.05）。2.4抑制素基因敲除小鼠的生殖器官大体观察将F2代抑制素基因敲除雄鼠与雌鼠交配，结果不育。将抑制素α基因敲除雌鼠与C57BL/6J雄鼠交配，仍然不育。观察发现，F2代及后续子代中抑制素α基因敲除雄鼠分笼饲养后，肉眼可见睾丸会逐渐增大。将抑制素基因敲除雄鼠和雌鼠解剖后观察其生殖系统，发现雄鼠的生殖系统发育异常，睾丸变大，颜色发黑，内有血液，附睾萎缩或被吸收入睾丸组织（图4A）；雌鼠的生殖系统同样发育异常，卵巢变大，颜色发黑，输卵管已萎缩或被吸收入卵巢组织，子宫粗大，内部充满液体（图4B）。表1F0代小鼠抑制素基因的TA克隆测序结果Table1TAcloningandgenesequencingresultsofinhibingeneinF0mice小鼠编号抑制素基因敲除区域长度/bp判定178910CCCGAACTTGTCCGGGAG-GGACCTCTGAACC
310实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineAug.2020,40(4)ABA为雄鼠睾丸组织，B为雌鼠卵巢；KO、HET和WT分别代表F2代小鼠的基因敲除纯合子、杂合子和野生型3种基因型。图4抑制素基因敲除小鼠的生殖器官观察Figure4Reproductiveorgansofinhibingeneknockoutmice(A,malemousetestis;B,femalemouseovary)体质量/gNC为C57BL/6J小鼠对照。KO、HET和WT分别代表F2代小鼠的基因敲除纯合子、杂合子和野生型3种基因型。**与野生型小鼠相比，P＜0.05。图3F2代小鼠的抑制素α基因PCR鉴定（A）和体质量比较（B）Figure3ElectrophoreticresultsofPCRproductsofinhibinαgene(A)andbodyweightofF2mice(B)B3种不同基因型小鼠OHETKWT3536373839404142434445464748495051NCA小鼠编号5253545556575859606162636465666768NC小鼠编号6970717273747576777879808182838485NC小鼠编号
【参考文献】：
期刊论文
[1]抑制素基因免疫诱导单胎绵羊孪生的研究[J]. 张德坤,杨利国,张红琳,王文,乌娜尔汗,纪平,古武昌. 中国农业大学学报. 2004(04)
本文编号：2914304
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