脂多糖诱导SD大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞炎症模型建立及特征分析
发布时间：2020-12-19 17:59
目的建立Sprague Dawley （SD）大鼠的正常膝关节滑膜细胞原代培养方法及脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）炎症模型。方法选取80～120 g SPF级幼年SD大鼠,分离其滑膜组织,原代培养至第3代,用组织化学染色法和Ed U法检测FLS蛋白标志物vimentin和增殖功能。同时,用滑膜组织作对照,检测第3代至第8代原代培养FLS的特征蛋白表达,筛选具有生理功能的高纯度且可用于后续实验的FLS细胞。LPS诱导FLS炎症后,检测LPS制激FLS不同时间点的IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达,根据实验结果确定LPS成功诱导FLS炎症模型的时间点。最后,检测FLS被LPS诱导前后的细胞因子、增殖功能和特征蛋白的表达,为分析FLS炎症模型提供实验数据。结果采用0.2%I型胶原酶消化法,成功培养了FLS原代细胞。经检测蛋白标志物vimentin,第3代FLS纯度达98%以上。通过FLS特征蛋白检测,筛选出具有生理功能且可用作后续实验的FLS为第3代至第7代原代细胞。通过...
【文章来源】：中国实验动物学报. 2020年04期 北大核心
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
SD大鼠正常滑膜细胞原代培养及其鉴定
建立实验动物的体内和体外模型，目的都是为了更好地研究疾病的发病机制、治疗方法及其效果评价，但动物的选择要根据实验需要和研究目的来确定，同时还要兼顾实验时间的长短、动物饲养成本的高低、操作难易程度等。为了研究RA的滑膜增生，陈芳等[16]改良了组织块法，分离培养了兔膝关节FLS。滑膜炎症是OA和RA等IJD的共同病理过程，其动物模型，应选择动物成熟期短，能满足较短的实验周期，且生存及抗感染能力较强的动物。据统计，目前1/4 OA动物模型选择大鼠作为实验动物[17]。大鼠模型能模拟人类IJD发病机制和病理过程，且具有操作方便易行、稳定性高、干扰因素少等特性。本实验不仅是建立滑膜FLS原代培养方法，更重要的是建立FLS炎症模型，所以我们选择了SPF级SD大鼠。建模获得成功，为研究IJD提供了良好的实验条件。在OA和RA等IJD中，由于可溶活性因子和细胞表面的相互作用激活FLS，合成并释放促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，激活免疫系统，从免疫防御转变为免疫破坏，破坏关节，改变关节正常功能[18]。越来越多的研究[19]显示:IJD滑液促炎因子分泌增加，滑膜明显增厚，其FLS异常增殖和侵袭。IJD中润滑素水平降低，透明质酸分子的数量下降，滑液的润滑能力也下降，增高了磷脂水平，脂肪链变短，不能有效减轻关节活动的摩擦力[20]。促炎因子在炎症模型的高表达，是模拟炎症病理状态的关键。尤欣等[21]以hIL-1β为炎症抗原诱导兔膝关节炎，检测到关节滑膜组织hIL-1βmRNA的表达，滑膜组织呈结节样增生，关节炎的严重程度与注入关节腔的MFG hIL-1β转染兔滑膜细胞数目成正相关。熊乐等[22]向大鼠坐骨神经断端显微注射LPS(2 g/L)1μL，术后1.5 h和24 h的IL-1βmRNA和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达明显升高。运用LPS诱导乳腺炎模型[12]，导致IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子释放异常增加，加重炎症。LPS作为炎症抗原，LPS激活了固有的免疫系统，可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、FLS、上皮细胞等合成和释放多种细胞因子和炎性介质，具有良好的一致性和重复性[12]。利用LPS制激FLS促进促炎因子的分泌，可以诱导出FLS的炎症病理过程，LPS诱导的FLS炎症模型，符合IJD的基本特征[20]。
IJD的主要特征是促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α高表达，通过一系列炎症级联反应和激活各类信号通路，调节下游因子，促使IJD的发生和加剧，直至关节破坏。IJD的临床症状是关节疼痛、僵硬和关节残废[14]。软骨降解在IJD的发病中起着重要作用，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是软骨降解的主要途径。促炎因子是激活p38-MAPK信号通路的主要因素之一，MAPK信号通路的异常激活又可促进炎症反应，导致软骨基质降解酶的释放，从而加速软骨退化[23]。体外FLS炎症模型的建立，对MAPK信号通路研究提供了工具。IL-1β是IJD首要致病因子之一，其可通过制激产生磷酸化的p38-MAPK来合成大量NO，反馈激活MAPK通路，促进IL-1β的产生，增加前列腺素E2及环氧化酶-2(COX-2)的水平，引起软骨损伤。TNF-α可介导多种炎症因子，可以与p38-MAPK形成正反馈环路，活化的p38-MAPK通路可促进TNF-α的表达，过度表达TNF-α可诱导软骨细胞凋亡。这些促炎因子通过各种途径激活信号通路，促使IJD的发生发展。NF-κB信号通路影响着OA、RA等IJD炎症反应的各个阶段。NF-κB信号通路参与血管内皮细胞黏附分子的表达并且与KOA患者淤血状态密切相关。淤血和患处新生毛细血管是关节疼痛的重要因素。NF-κB信号通路也是软骨降解进程中的关键分子途径，其通过促进MMP-1、MMP-2、MMP-3等多种降解酶的分泌及COX-2、NO等分解代谢因子的合成，加剧关节炎软骨的凋亡和软骨的炎症反应[24]。TNF-α对FLS的增殖有促进作用，可使滑膜组织纤维样变并增加滑液中的炎症因子，加重病情。FLS还具有类似肿瘤细胞增殖的特性，可突破生理屏障侵入软骨和骨，导致关节破坏。FLS入侵体参与FLS与软骨的附着，其内富含基质金属蛋白酶，可特异性地使细胞外基质变性[25]。LPS既是炎症抗原，又是NF-κB的激动剂，运用LPS诱导体外FLS炎症模型的建立，有利于进行信号通路的干预，探讨如何降低IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF和MMP等蛋白的表达，从而减弱或抑制住IJD诱导的疼痛和炎症，延缓或阻止关节退变，达到治疗的目的。图5 荧光qRT-PCR法和Western Blot法检测1000 ng/m L LPS制激FLS后不同时间点IL-1β和TNF-α的表达(n=5)
【参考文献】：
期刊论文
[1]栀子苷对乳腺炎动物模型IL-6、TNF-α和IL-1β表达的影响[J]. 黄永周,李漪,丛竹军. 中国比较医学杂志. 2018(11)
[2]S100钙结合蛋白B在骨性关节炎软骨损伤修复中的作用及机制研究[J]. 朱立帆,周建新,曾金才,张晓剑,沈鹏程,翁峰标. 中国修复重建外科杂志. 2018(11)
[3]脂多糖干预对大鼠周围神经损伤后瓦勒变性的影响[J]. 熊乐,张倩,沈若武,边洪琳,孙广强,王毅,张凤玉,张蓓. 中国实验动物学报. 2017(02)
[4]改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞[J]. 陈芳,刘琴,王丽平,陈利峰,张宜. 中国比较医学杂志. 2016(04)
[5]佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维细胞模型建立及特征分析[J]. 高皖皎,邓秋狄,白殊同,佟丽. 中国药理学通报. 2015(12)
[6]D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠慢性肝损伤模型的建立[J]. 翟亚南,王晶晶,李梦,池亚菲,孟霞,彭博雅,焦昆,卢静. 中国比较医学杂志. 2014(05)
[7]RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定[J]. 丁娟,王志军,董晓薇,张淑雅,芦晓红,赵薇. 现代生物医学进展. 2012(36)
[8]滑膜病变在骨关节炎中的表现[J]. 宋朋飞,阚卫兵,袁琴,赵婧,谢殿洪,王拥军. 中国骨伤. 2012(05)
[9]人白介素-1β诱导兔膝关节炎模型的临床及病理特点[J]. 尤欣,唐福林,吴士宏,王迁. 中国实验动物学报. 2004(02)
本文编号：2926334
【文章来源】：中国实验动物学报. 2020年04期 北大核心
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
SD大鼠正常滑膜细胞原代培养及其鉴定
建立实验动物的体内和体外模型，目的都是为了更好地研究疾病的发病机制、治疗方法及其效果评价，但动物的选择要根据实验需要和研究目的来确定，同时还要兼顾实验时间的长短、动物饲养成本的高低、操作难易程度等。为了研究RA的滑膜增生，陈芳等[16]改良了组织块法，分离培养了兔膝关节FLS。滑膜炎症是OA和RA等IJD的共同病理过程，其动物模型，应选择动物成熟期短，能满足较短的实验周期，且生存及抗感染能力较强的动物。据统计，目前1/4 OA动物模型选择大鼠作为实验动物[17]。大鼠模型能模拟人类IJD发病机制和病理过程，且具有操作方便易行、稳定性高、干扰因素少等特性。本实验不仅是建立滑膜FLS原代培养方法，更重要的是建立FLS炎症模型，所以我们选择了SPF级SD大鼠。建模获得成功，为研究IJD提供了良好的实验条件。在OA和RA等IJD中，由于可溶活性因子和细胞表面的相互作用激活FLS，合成并释放促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，激活免疫系统，从免疫防御转变为免疫破坏，破坏关节，改变关节正常功能[18]。越来越多的研究[19]显示:IJD滑液促炎因子分泌增加，滑膜明显增厚，其FLS异常增殖和侵袭。IJD中润滑素水平降低，透明质酸分子的数量下降，滑液的润滑能力也下降，增高了磷脂水平，脂肪链变短，不能有效减轻关节活动的摩擦力[20]。促炎因子在炎症模型的高表达，是模拟炎症病理状态的关键。尤欣等[21]以hIL-1β为炎症抗原诱导兔膝关节炎，检测到关节滑膜组织hIL-1βmRNA的表达，滑膜组织呈结节样增生，关节炎的严重程度与注入关节腔的MFG hIL-1β转染兔滑膜细胞数目成正相关。熊乐等[22]向大鼠坐骨神经断端显微注射LPS(2 g/L)1μL，术后1.5 h和24 h的IL-1βmRNA和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达明显升高。运用LPS诱导乳腺炎模型[12]，导致IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子释放异常增加，加重炎症。LPS作为炎症抗原，LPS激活了固有的免疫系统，可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、FLS、上皮细胞等合成和释放多种细胞因子和炎性介质，具有良好的一致性和重复性[12]。利用LPS制激FLS促进促炎因子的分泌，可以诱导出FLS的炎症病理过程，LPS诱导的FLS炎症模型，符合IJD的基本特征[20]。
IJD的主要特征是促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α高表达，通过一系列炎症级联反应和激活各类信号通路，调节下游因子，促使IJD的发生和加剧，直至关节破坏。IJD的临床症状是关节疼痛、僵硬和关节残废[14]。软骨降解在IJD的发病中起着重要作用，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是软骨降解的主要途径。促炎因子是激活p38-MAPK信号通路的主要因素之一，MAPK信号通路的异常激活又可促进炎症反应，导致软骨基质降解酶的释放，从而加速软骨退化[23]。体外FLS炎症模型的建立，对MAPK信号通路研究提供了工具。IL-1β是IJD首要致病因子之一，其可通过制激产生磷酸化的p38-MAPK来合成大量NO，反馈激活MAPK通路，促进IL-1β的产生，增加前列腺素E2及环氧化酶-2(COX-2)的水平，引起软骨损伤。TNF-α可介导多种炎症因子，可以与p38-MAPK形成正反馈环路，活化的p38-MAPK通路可促进TNF-α的表达，过度表达TNF-α可诱导软骨细胞凋亡。这些促炎因子通过各种途径激活信号通路，促使IJD的发生发展。NF-κB信号通路影响着OA、RA等IJD炎症反应的各个阶段。NF-κB信号通路参与血管内皮细胞黏附分子的表达并且与KOA患者淤血状态密切相关。淤血和患处新生毛细血管是关节疼痛的重要因素。NF-κB信号通路也是软骨降解进程中的关键分子途径，其通过促进MMP-1、MMP-2、MMP-3等多种降解酶的分泌及COX-2、NO等分解代谢因子的合成，加剧关节炎软骨的凋亡和软骨的炎症反应[24]。TNF-α对FLS的增殖有促进作用，可使滑膜组织纤维样变并增加滑液中的炎症因子，加重病情。FLS还具有类似肿瘤细胞增殖的特性，可突破生理屏障侵入软骨和骨，导致关节破坏。FLS入侵体参与FLS与软骨的附着，其内富含基质金属蛋白酶，可特异性地使细胞外基质变性[25]。LPS既是炎症抗原，又是NF-κB的激动剂，运用LPS诱导体外FLS炎症模型的建立，有利于进行信号通路的干预，探讨如何降低IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF和MMP等蛋白的表达，从而减弱或抑制住IJD诱导的疼痛和炎症，延缓或阻止关节退变，达到治疗的目的。图5 荧光qRT-PCR法和Western Blot法检测1000 ng/m L LPS制激FLS后不同时间点IL-1β和TNF-α的表达(n=5)
【参考文献】：
期刊论文
[1]栀子苷对乳腺炎动物模型IL-6、TNF-α和IL-1β表达的影响[J]. 黄永周,李漪,丛竹军. 中国比较医学杂志. 2018(11)
[2]S100钙结合蛋白B在骨性关节炎软骨损伤修复中的作用及机制研究[J]. 朱立帆,周建新,曾金才,张晓剑,沈鹏程,翁峰标. 中国修复重建外科杂志. 2018(11)
[3]脂多糖干预对大鼠周围神经损伤后瓦勒变性的影响[J]. 熊乐,张倩,沈若武,边洪琳,孙广强,王毅,张凤玉,张蓓. 中国实验动物学报. 2017(02)
[4]改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞[J]. 陈芳,刘琴,王丽平,陈利峰,张宜. 中国比较医学杂志. 2016(04)
[5]佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维细胞模型建立及特征分析[J]. 高皖皎,邓秋狄,白殊同,佟丽. 中国药理学通报. 2015(12)
[6]D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠慢性肝损伤模型的建立[J]. 翟亚南,王晶晶,李梦,池亚菲,孟霞,彭博雅,焦昆,卢静. 中国比较医学杂志. 2014(05)
[7]RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定[J]. 丁娟,王志军,董晓薇,张淑雅,芦晓红,赵薇. 现代生物医学进展. 2012(36)
[8]滑膜病变在骨关节炎中的表现[J]. 宋朋飞,阚卫兵,袁琴,赵婧,谢殿洪,王拥军. 中国骨伤. 2012(05)
[9]人白介素-1β诱导兔膝关节炎模型的临床及病理特点[J]. 尤欣,唐福林,吴士宏,王迁. 中国实验动物学报. 2004(02)
本文编号：2926334
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