B型肉毒毒素轻链蛋白特异性抗体的筛选及其活性测定

发布时间：2017-04-08 14:26

  本文关键词：B型肉毒毒素轻链蛋白特异性抗体的筛选及其活性测定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肉毒毒素是肉毒杆菌产生的一种高分子蛋白神经毒素,是目前已知在天然与合成毒素中毒性最强的一种生物毒素。它主要是抑制乙酰胆碱神经递质的释放,从而引起肌肉麻痹,严重的会导致死亡。B型肉毒毒素在欧洲被称为Neurobloc,也是导致人类肉毒中毒的一种类型。目前有关B型肉毒毒素的研究较少,还没有B型肉毒中毒的救治药物和治疗方法。噬菌体抗体库Tomlinson I+J是由英国剑桥MRC HGMP(Human Genome Mapping)资源中心建立的,文库拥有1×108单链抗体scFv基因片段,库容量大,多样性高,在未知所筛选物克隆序列的情况下,利用这两个文库,可筛选得到高度亲和力的特异性抗体。因此,这将会为B型肉毒毒素中毒研制特效药及开发B型肉毒毒素抗体制剂奠定坚实的基础。鉴于肉毒毒素轻链在肉毒毒素中毒中的核心作用,本研究通过诱导表达B型肉毒毒素轻链蛋白,得到纯度达90%的蛋白。以此为抗原通过噬菌体抗体库Tomlinson I+J四轮富集筛选,得到数几十株阳性菌株,加诱导剂IPTG诱导表达抗B型肉毒毒素轻链的人源单链抗体。抗体活性的有无或大小至关重要,本实验采用的是绿色荧光蛋白标记法。GFP即绿色荧光蛋白,在蓝色波长范围的光线下激发,能产生绿色荧光,是一种活体报告蛋白。人工合成了SV蛋白的基因,其表达的蛋白质序列包含了SNAP25和VAMP中各型肉毒毒素的切割位点,将绿色荧光蛋白基因(GFP)与SV基因相连成重组基因GFP-SV,并克隆入pET-28a表达载体中,表达并纯化融合蛋白GFP-SV。利用GFP-SV作为底物,根据绿色荧光蛋白的荧光数值变化测定Bont-B抗体的活性。通过人源化噬菌体库筛选及活性检测,获得了三株具有Bont-B中和活性的抗体细胞株,其亲和常数分别为4H(4.38±0.445)×105L/mol,7A(5.35±0.903)×105L/mol,7B(1.146±0.525)×106L/mol。
【关键词】：B型肉毒毒素轻链 噬菌体抗体库I+J 抗体 GFP 活性
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 前言7-9
• 第一篇 综述9-17
• 第一章 肉毒毒素9-14
• 1.1 肉毒梭菌9
• 1.2 肉毒毒素9-10
• 1.3 B型肉毒毒素结构特点10-11
• 1.4 B型肉毒毒素的轻链11
• 1.5 肉毒毒素作用机理11-13
• 1.6 SNARE蛋白复合体13-14
• 第二章 噬菌体展示技术14-17
• 2.1 概念14
• 2.2 噬菌体展示技术的原理14
• 2.3 噬菌体展示系统14-15
• 2.4 从噬菌体抗体库中筛选特异性抗体15
• 2.5 噬菌体抗体库的筛选方法15-16
• 2.6 人源化单克隆抗体库I+J16-17
• 第二篇 研究内容17-49
• 第一章B型肉毒毒素轻链蛋白的表达与纯化17-22
• 1.1 材料17-19
• 1.2 方法19-20
• 1.3 结果20-21
• 1.4 讨论21
• 1.5 小结21-22
• 第二章 筛选B型肉毒毒素轻链蛋白特异性抗体22-29
• 2.1 材料22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.3 结果27-28
• 2.4 讨论28
• 2.5 小结28-29
• 第三章 重组质粒GFP-SV的构建及其蛋白的表达纯化29-43
• 3.1 材料29-31
• 3.2 方法31-38
• 3.3 结果38-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 第四章 抗体的活性检测及其亲和常数的测定43-49
• 4.1 材料43-44
• 4.2 方法44-45
• 4.3 结果45-47
• 4.4 讨论47-48
• 4.5 小结48-49
• 参考文献49-53
• 附录A53-54
• 附录B54
• 附录C54-58
• 作者简介58-59
• 致谢59

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