金黄色葡萄球菌凝固酶coa基因的克

发布时间：2021-01-01 03:28

　　目的体外表达金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）凝固酶Coa,评价其生物学活性。方法根据GenBank中金黄色葡萄球菌凝固酶coa基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从S.aureus USA300 CA-MRSA 923株基因组中扩增coa基因片段,将其克隆至pET-24b（+）表达载体,构建重组表达质粒pET-24b-coa;将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE和Western blot对表达的重组Coa（rCoa）进行鉴定,测定rCoa对人血液和兔血浆的凝固活性;最后用纯化的重组蛋白rCoa免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和Western blot分析其免疫原性。结果构建的重组质粒pET-24b-coa在E.coli BL21（DE3）中以包涵体形式表达rCoa,分子量约74.8 ku,与预期蛋白大小相符;rCoa在体外具有凝固人全血和兔血浆活性,能刺激小鼠产生高效价的抗Coa特异性抗体。结论成功地获得了具有良好凝固酶活性和抗原性的金黄色葡萄球... 

【文章来源】：中国人兽共患病学报. 2020年09期 北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

coa基因的PCR扩增

coa基因的PCR扩增及重组质粒pET-24b-coa的酶切鉴定

表达菌E.coli BL21(DE3)经1 mmol/L IPTG诱导1、2、3、4、6 h 进行SDS-PAGE分析,在诱导1 h时,rCoa蛋白开始表达,在相对分子质量约为74.8 ku 处有明显的蛋白质表达条带,与目的蛋白基本一致,但表达量较低。当诱导4 h和6 h时rCoa蛋白表达量差不多,达到最高,因此在蛋白表达时选择诱导时间为4 h。阴性对照含空载体pET-24b(+)的工程菌和未诱导对照菌中未见有目的蛋白表达(图3)。2.3 重组蛋白的表达形式

【参考文献】：
期刊论文
[1]金黄色葡萄球菌血浆凝固酶克隆、表达、纯化及其生物活性研究[J]. 张叶影,崔海亮,杨静,葛新,王越,屈野.  武警后勤学院学报(医学版). 2017(12)



本文编号：2950865