自噬调控神经干细胞的分化潜能

发布时间：2017-04-10 07:58

  本文关键词：自噬调控神经干细胞的分化潜能，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察源自不同年龄阶段小鼠神经干细胞(NSCs)分化能力的改变,与自噬基因的表达变化,探讨自噬对NSCs分化能力的调控作用。方法:分离提取胚胎14d(E14)、新生(P0)、生后30d(P30)和90d(P90)小鼠NSCs,应用NSCs标记物nestin进行免疫荧光染色鉴定实验。NSCs经1%胎牛血清诱导分化后,Tuj1和GFAP免疫荧光染色比较不同年龄NSCs分化为神经元和胶质细胞的比例。分离培养P0和P300小鼠NSCs制备超薄切片,应用透射电镜观察NSCs超微结构。采用SYBR Green Real-time PCR(QPCR)分析不同年龄小鼠侧脑室室管膜下区(SVZ)和不同年龄阶段NSCs,自噬相关基因ATG3,ATG5,ATG7及Beclin1的表达变化。另外,观察NSCs分化前后自噬相关基因的表达变化。并且分别应用1μM、5μM和10μM自噬抑制剂Ly294002作用于NSCs,通过Tuj1和GFAP免疫荧光染色分析自噬对神经干细胞分化能力的影响。结果:1.随着年龄增长NSCs形成神经球的平均直径降低,P30和P90 NSCs形成70~100μm神经球的数量较E14和P0降低~65%。诱导分化实验结果显示随年龄增加,NSCs分化为神经元的比例降低(P0.05),而分化为星形胶质细胞的能力上升(P0.05)。其中P90小鼠Tuj1的阳性率为8%±2%,较E14小鼠(29%±3%)明显下降(P0.01)而其GFAP阳性细胞率为72%±4%,较E14小鼠(39%±3%)明显升高(P0.01)。2.透射电镜结果显示P300 NSCs线粒体嵴出现断裂肿胀,正常状态的线粒体数目较P0明显减少,并且内聚集大量自噬小体,提示P300 NSCs自噬功能降低。QPCR结果显示随年龄增长SVZ自噬相关基因ATG3、ATG5、ATG7的表达水平降低,但Beclin1表达水平无显著变化。P90 NSCs ATG3、ATG5、ATG7和Beclin1表达水平分别较E14下降约60%、52%、66%和84%。提示随着年龄增长NSCs自噬活性逐步下调。3.NSCs诱导分化培养5d后,Tuj1和GFAP的表达量分别较对照组增高4.30±0.65倍(P0.05)和11.39±0.35倍(P0.05)。同时,ATG3、ATG5、ATG7和Beclin1m RNA表达水平分别较未分化前增高1.47±0.34(P0.05)、1.66±0.79(P0.05)、4.31±0.94(P0.05)和3.73±2.56(P0.05);提示自噬可能参与了NSCs向神经元和星形胶质细胞的分化。分别用1μM、5μM和10μM自噬抑制剂Ly294002干预E14 NSCs分化后,发现ly294002能够抑制NSCs向神经元分化,并且表现出浓度依赖性,而对星形胶质细胞无明显影响。Ly294002处理组Tuj1的阳性率分别为DMSO组的109%±2%(P0.05)、41%±2%(P0.05)和30%±1%(P0.05);而Ly294002处理组GFAP的阳性率分别为DMSO组的112%±1%(P0.05)、89%±2%(P0.05)和113%±3%(P0.05),提示自噬主要调控NSCs向神经元的分化。结论:1.随年龄增长NSCs分化为神经元的数量逐渐减少,而分化为星形胶质细胞的比例上升。2.成年NSCs内自噬小体堆积并且自噬相关基因的表达水平显著降低,提示自噬与NSCs功能维持相关。3.自噬参与调控NSCs分化,抑制自噬导致NSCs分化为神经元的比例降低。
【关键词】：NSCs 分化 自噬
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 常用缩写词中英文对照表9-10
• 前言10-12
• 1 材料与方法12-22
• 1.1 材料与试剂12-13
• 1.2 实验方法13-21
• 1.3 统计学处理21-22
• 2 结果22-29
• 2.1 不同年龄NSCs的培养22-24
• 2.2 不同年龄NSCs分化能力的比较24-25
• 2.3 检测NSCs内自噬现象25-26
• 2.4 自噬对NSCs分化能力的影响26-29
• 3 讨论29-32
• 4 结论32-33
• 参考文献33-37
• 综述37-51
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果52-53
• 个人简历53

【参考文献】

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1 Corinne A.Lee-Kubli;Paul Lu;;Induced pluripotent stem cell-derived neural stem cell therapies for spinal cord injury[J];Neural Regeneration Research;2015年01期

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本文编号：296218