兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的研究

发布时间：2017-04-10 13:18

  本文关键词：兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】本试验通过在体外添加不同生长因子,拟探索稳定高效的体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛β细胞的诱导体系,为进一步进行深入研究及临床实践中应用干细胞移植治疗糖尿病奠定试验基础及临床指导意义。【方法】分别采用全骨髓贴壁法和红细胞裂解法体外分离获取兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),倒置显微镜观察细胞形态、采用台盼蓝染色法检测细胞活性、记录两种分离方法首次达到传代的时间、细胞免疫组化法鉴定CD90、CD44、CD34表面抗原的表达;分别在原代培养12 h、24 h、48 h、72 h时首次换液,以后每3 d换液一次,记录各组各代培养时间及培养总周期,筛选出最佳首次换液时间;取生长良好的P3代细胞,采用添加体外生长因子三步法,分阶段将兔BMSCs体外诱导为胰岛细胞,第一阶段用含有10ng/mLbFGF、1%DMSO、1%FBS、23 mmol/LGlucose的H-DMEM培养液对BMSCs诱导3d,第二阶段用含有10 ng/mLbFGF、10 ng/mLEGF、2%B27、10 mmol/L尼克酰胺、17.5mmol/LGlucose的无血清DMEM/F-12培养液对BMSCs诱导8 d,第三阶段用含有10mmol/LHEPES、10 mmol/L尼克酰胺,2 nmol/L的activin-A,11.1 mmol/LGlucose的RPMI1640培养液对兔BMSCs诱导8 d,倒置显微镜下观察其形态学变化;双硫腙染色鉴定细胞团;胰岛细胞特异性基因(Pdx-1、Insulin、Nkx6.1)的表达用RT-PCR方法检测;免疫细胞化学法检测特异性蛋白(胰岛素蛋白)的表达;ELISA检测胰岛素分泌的情况。【结果】两种分离方法均能获得较均一的长梭形细胞,所培养细胞CD90、CD44抗原阳性表达,CD34抗原阴性表达。其中红细胞裂解法所得细胞活性较全骨髓贴壁法高,首次传代时间短,差异显著(P0.05);24h首次换液各代达传代时间所需时间与其他各组比较差异极显著(P0.01),为最佳首次换液时间,可显著缩短细胞培养周期;第一阶段诱导末(3 d),细胞形态无明显变化,部分细胞变圆,双硫腙染色不着色,RT-PCR未检测到任何特异性基因的表达;诱导第7 d时,细胞逐渐融合,细胞簇增多,直径变大,双硫腙染色细胞团呈棕红色,仅检测到PDX-1基因的表达,证实其为胰岛前体细胞;第二阶段诱导末(11 d),细胞簇数目增多,细胞边缘突起,检测到PDX-1、Insulin的表达;第三阶段诱导末,细胞团状物与周围组织分离,形成类胰岛样结构,双硫腙染色细胞呈红棕色,PDX-1、Insulin、Nkx6.1基因均表达;免疫细胞化学法检测细胞内胰岛素蛋白的表达,试验组细胞胞浆内出现大量棕黄色颗粒,结果呈阳性反应,对照组细胞胞浆内未出现棕黄色颗粒,结果呈阴性反应;诱导3、7、11、15、19 d的胰岛素分泌量分别为(27.86±0.034μIU/mL)、(29.33±0.48μIU/mL)、(29.92±0.46μIU/mL)、(31.32±0.03μIU/mL),与对照组(20.54±0.21μIU/mL)、(22.10±0.45μIU/mL)、(22.36±0.35μIU/mL)、(23.39±0.20μIU/mL),3 d时诱导组与对照组相比差异不显著,因为此时未出现细胞团样变化,未分泌胰岛素,7 d、11 d、19 d差异均显著(P0.05)。【结论】采用红细胞裂解液法,24h首次换液能够明显缩短骨髓间充质干细胞的培养周期,所得细胞生长增值能力强、纯度高、生物学特性稳定,具有多向分化能力;在体外采用生长因子三阶段诱导法,能够诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成熟的具有功能性的胰岛β细胞。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 红细胞裂解液法 全骨髓贴壁法 生长因子 胰岛β细胞 诱导分化 兔
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 致谢5-9
• 摘要9-11
• 文献综述11-18
• 1 骨髓间充质干细胞的研究进展12-15
• 1.1 BMSCs的发现和分布12
• 1.2 BMSCs的生物学特性12-13
• 1.3 BMSCs的分离方法13
• 1.4 BMSCs定向分化的机制13-14
• 1.5 BMSCs的应用前景14-15
• 2 BMSCs向胰岛细胞分化的研究进展15-18
• 2.1 BMSCs向胰岛细胞定向诱导分化方法的研究15-17
• 2.1.1 诱导剂法15-16
• 2.1.2 转录因子调控法16-17
• 2.1.3 共培养法17
• 2.2 BMSCs胰岛样分化在临床上的应用17-18
• 试验一 不同分离方法及首次换液时间对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响18-27
• 引言18
• 1 材料与方法18-21
• 1.1 试验材料18-19
• 1.1.2 主要试剂18
• 1.1.3 主要仪器与器材18-19
• 1.2 试剂的配制19-20
• 1.2.1 PBS缓冲液配制19
• 1.2.2 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液19
• 1.2.3 双抗配制19
• 1.2.4 FBS的冻融19
• 1.2.5 DMEM/F-12完全培养基19
• 1.2.6 台盼蓝染色液19-20
• 1.3 试验方法20-21
• 1.3.1 BMSCs的提取20
• 1.3.2 全骨髓贴壁法20
• 1.3.3 红细胞裂解法20
• 1.3.4 兔BMSCs细胞活性检测20
• 1.3.5 兔BMSCs生长曲线的绘制20-21
• 1.3.6 首次换液时间对兔BMSCs的影响21
• 1.3.7 细胞免疫组化鉴定兔BMSCs21
• 1.3.8 统计学处理21
• 2 结果与分析21-24
• 2.1 不同分离方法对兔BMSCs形态和生长的影响21-23
• 2.2 兔BMSCs生长曲线绘制23-24
• 2.3 兔BMSCs的鉴定24
• 2.4 首次换液时间对兔BMSCs培养周期的影响24
• 3 讨论24-26
• 4 小结26-27
• 试验二 兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的动态变化的研究27-39
• 引言27
• 1 材料27-29
• 1.1 试验材料27-28
• 1.1.1 试验对象27
• 1.1.2 主要试剂27-28
• 1.1.3 主要仪器与器械28
• 1.2 主要试剂配制28-29
• 1.2.1 生长因子（bFGF，EGF，activin-A，HGF）配制为 1μg/mL28
• 1.2.2 配制 1mol/L HEPES28
• 1.2.3 不同浓度（0.23mol/L，0.175mol/L，0.111 mol/L）葡萄糖的配制28-29
• 1.2.4 第一阶段的诱导剂29
• 1.2.5 第二阶段的诱导剂29
• 1.2.6 第三阶段的诱导剂29
• 1.2.7 双硫腙染色剂29
• 1.2.8 0.2％TritonX-10029
• 1.2.9 DAB显色液29
• 2 试验方法29-33
• 2.1 体外定向诱导分化29-30
• 2.2 双硫腙染色30
• 2.3 RT-PCR检测胰岛细胞特异性基因的表达30-32
• 2.3.1 细胞总RNA的提取30-31
• 2.3.2 反转录合成c DNA31
• 2.3.3 PCR反应31-32
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳32
• 2.4 免疫组织化学染色32
• 2.5 ELISA检测32-33
• 2.6 数据处理33
• 3 结果与分析33-37
• 3.1 诱导分化过程中细胞的形态学变化33-34
• 3.2 DTZ染色鉴定结果34
• 3.3 RT-PCR检测胰岛细胞特异性基因表达34-35
• 3.4 免疫细胞化学检测结果35-36
• 3.5 ELISA检测结果36-37
• 4 讨论37-38
• 5 小结38-39
• 结论39-40
• 参考文献40-49
• 英文缩写词表49-50
• ABSTACT50-51

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