乳酸菌胞外多糠的筛
发布时间：2021-01-19 02:34
乳酸菌胞外多糖（Lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS）具有多种生物活性,对其研究与开发具有重要的实际意义与良好的应用前景。本研究以实验室保存鉴定的乳酸菌为出发菌株,筛选能够增强细胞免疫活性的乳酸菌EPS,随后将其进行分离纯化及结构初步鉴定,在此基础上探讨其对免疫细胞活性及机体特异性免疫应答的影响。结果如下:1.对实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定,筛选10株高产EPS 乳酸杆菌,其中Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobaillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS可以增强巨噬细胞增殖、吞噬以及NO释放能力。2.将上述 Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29 和Lactobacillus casei SXJ30 所产 EPS 经过 DEAE-Sepharose Fast Flow 和 Sepharose CL-6B色谱柱进行分离纯化后获得主要均...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 乳酸菌概述
1.2 多糖概述
1.3 乳酸菌胞外多糖
1.3.1 乳酸菌胞外多糖简介
1.3.2 不同乳酸菌对EPS产量的影响
1.3.3 EPS的提取、分离与纯化
1.3.4 EPS的分子量和单糖组成
1.3.5 乳酸菌EPS的生物学功能
1.4 多糖对特异性免疫应答的影响
1.4.1 特异性免疫
1.4.2 由T细胞介导的细胞免疫应答
1.4.3 由B细胞介导的体液免疫应答
1.4.4 多糖对机体特异性免疫应答的影响
1.5 本课题的研究内容和意义
第二章 乳杆菌胞外多糖的筛选
2.1 材料与仪器
2.1.1 菌株
2.1.2 细胞株
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 乳酸菌菌株活化
2.2.2 菌种产糖量测定
2.2.3 硫酸-苯酚法测定多糖含量
2.2.4 粗EPS的提取
2.2.5 EPS刺激巨噬细胞RAW264.7和Ana-1增殖
2.2.6 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞吞噬中性红
2.2.7 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞释放NO
2.3 实验结果
2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制
2.3.2 乳酸菌胞外多糖含量测定结果
2.3.3 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞的增殖结果
2.3.4 EPS刺激RAW264.7和Ana-1吞噬中性红的结果
2.3.5 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞释放NO的结果
2.4 分析与讨论
第三章 三种乳杆菌胞外多糖的分离纯化
3.1 材料与设备
3.1.1 菌株和发酵条件
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换纯化
3.2.2 EPS的Sepharose CL-6B分子筛纯化
3.2.3 紫外光谱扫描
3.2.4 红外光谱分析
3.2.5 多角度激光光散射仪测定多糖分子量
3.2.6 离子色谱测定单糖组成
3.3 实验结果
3.3.1 三种EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换纯化结果
3.3.2 三种EPS的Sepharose CL-6B分子筛纯化结果
3.3.3 三种EPS的紫外光谱扫描结果
3.3.4 三种EPS的红外扫描结果
3.3.5 三种EPS的分子量测定结果
3.3.6 三种EPS的单糖组成测定
3.4 分析与讨论
第四章 三种乳杆菌胞外多糖对巨噬细胞免疫活性的影响
4.1 材料与设备
4.1.1 细胞株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.1.4 溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 巨噬细胞RAW264.7和Ana-1的培养
4.2.2 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞增殖
4.2.3 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞吞噬中性红
4.2.4 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞释放NO
4.2.5 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞分泌TNF-α
4.2.6 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞分泌IL-1β
4.2.7 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞分泌IL-6
4.2.8 巨噬细胞表面标志免疫荧光标记和流式细胞仪检测
4.3 实验结果
4.3.1 不同浓度EPS对巨噬细胞增殖情况检测结果
4.3.2 不同浓度EPS刺激巨噬细胞吞噬中性红能力的检测结果
4.3.3 不同浓度EPS刺激巨噬细胞释放NO的结果
4.3.4 不同浓度EPS刺激巨噬细胞分泌TNF-α的结果
4.3.5 不同浓度EPS刺激巨噬细胞分泌IL-1β的结果
4.3.6 不同浓度EPS刺激巨噬细胞分泌IL-6的结果
4.3.7 SXJ30 EPS刺激巨噬细胞24 h后表面标志表达结果
4.3.8 SXJ30 EPS刺激巨噬细胞48h后表面标志表达结果
4.3.9 SXJ30 EPS刺激巨噬细胞72 h后表面标志表达结果
4.4 分析与讨论
第五章 干酪乳杆菌SXJ30胞外多糖对树突状细胞免疫活性的影响
5.1 材料与设备
5.1.1 实验动物
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器设备
5.1.4 溶液配制
5.2 实验方法
5.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的分离培养
5.2.2 BMDCs表面标志免疫荧光标记和流式细胞仪检测
5.2.3 ELISA检测BMDC上清中TNF-α的含量
5.2.4 ELISA检测BMDC上清中IL-6的含量
5.2.5 ELISA检测BMDC上清中IL-10的含量
5.2.6 ELISA检测BMDC上清中IL-12的含量
5.3 实验结果
5.3.1 小鼠BMDCs培养结果
5.3.2 SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs表面标志表达结果
5.3.3 SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后细胞因子的分泌
5.3.4 SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后IL-10/IL-12的比值
5.4 分析与讨论
第六章 干酪乳杆菌SXJ30胞外多糖增强OVA特异性免疫应答的影响
6.1 材料与设备
6.1.1 实验动物
6.1.2 主要试剂
6.1.3 主要仪器设备
6.2 实验方法
6.2.1 小鼠分组及免疫程序
6.2.2 OVA特异性IgG抗体水平的检测
6.2.3 OVA特异性IgG亚类抗体水平的检测
6.2.4 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖检测
6.2.5 脾脏T淋巴细胞上清中细胞因子的检测
6.2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞胞内因子染色及流式细胞检测
6.2.7 小鼠脾脏树突状细胞表面染色及检测
6.3 实验结果
6.3.1 OVA特异性IgG抗体水平的检测结果
6.3.2 OVA特异性IgG抗体亚类IgG1,IgG2a相IgG2b水平的检测结果
6.3.3 SXJ30 EPS对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力检测结果
6.3.4 SXJ30 EPS对小鼠脾脏T淋巴细胞上清中细胞因子的检测结果
6.3.5 小鼠脾脏T淋巴细胞胞内因子检测结果
6.3.6 SXJ30 EPS刺激小鼠脾脏DCs表面标志表达的结果
6.4 分析与讨论
结论
创新点及展望
1 创新点
2 展望
参考文献
致谢
硕士期间发表论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母细胞壁多糖对肉鸡生长性能、免疫器官发育及盲肠微生物的影响[J]. 贺淼,黄鑫,李彪,胡骏鹏. 饲料工业. 2015(10)
[2]硒化乳酸菌胞外多糖对小鼠腹腔巨噬细胞及肿瘤细胞内游离Ca2+的影响[J]. 刘鹭,潘道东,丁琳,曾小群. 食品科学. 2014(01)
[3]淫羊藿多糖对鸡免疫功能及疫苗免疫效果的影响[J]. 罗燕,邵永斌,谷新利,李星艳. 中国家禽. 2009(01)
[4]乳酸菌胞外多糖分离纯化方法研究进展[J]. 王瑞琼,张红星,熊利霞,易欣欣,刘慧. 食品科学. 2008(08)
[5]M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析[J]. 李康,郭强,王翠妮,陈敏,徐薇,熊思东. 现代免疫学. 2008(03)
[6]苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 王文平,郭祀远,李琳,王明力,梁桂娟. 食品科学. 2007(04)
[7]Exopolysaccharides from Marine Bacteria[J]. CHI Zhenming, and FANG Yan UNESCO Chinese Center of Marine Biotechnology, Ocean University of China, Qingdao 266003, P. R. China. Journal of Ocean University of China. 2005(01)
[8]乳酸菌胞外多糖[J]. 赵玉臣,王迎俊,王忠凤. 中国乳业. 2003(04)
[9]距骨多糖 （APS）和距骨类黄酮 （AF）对活体外正常老鼠细胞和瘤变老鼠细胞的淋巴细胞繁殖及T-淋巴细胞亚群的影响（英文）[J]. 钟鸣,张德山,Murata J,Saiki I,山本格. 四川大学学报(自然科学版). 2001(06)
[10]脂多糖刺激RAW264.7和Ana-1形态改变及细胞因子表达的差异[J]. 石榴,方怡,袁伟锋,李理,黄文杰. 国际呼吸杂志. 2009 (13)
博士论文
[1]植物乳杆菌胞外多糖发酵、结构鉴定及其功能特性研究[D]. 冯美琴.南京农业大学 2012
[2]植物活性多糖对小鼠树突状细胞和巨噬细胞功能的调节作用[D]. 黄丹菲.南昌大学 2009
本文编号：2986162
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 乳酸菌概述
1.2 多糖概述
1.3 乳酸菌胞外多糖
1.3.1 乳酸菌胞外多糖简介
1.3.2 不同乳酸菌对EPS产量的影响
1.3.3 EPS的提取、分离与纯化
1.3.4 EPS的分子量和单糖组成
1.3.5 乳酸菌EPS的生物学功能
1.4 多糖对特异性免疫应答的影响
1.4.1 特异性免疫
1.4.2 由T细胞介导的细胞免疫应答
1.4.3 由B细胞介导的体液免疫应答
1.4.4 多糖对机体特异性免疫应答的影响
1.5 本课题的研究内容和意义
第二章 乳杆菌胞外多糖的筛选
2.1 材料与仪器
2.1.1 菌株
2.1.2 细胞株
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 乳酸菌菌株活化
2.2.2 菌种产糖量测定
2.2.3 硫酸-苯酚法测定多糖含量
2.2.4 粗EPS的提取
2.2.5 EPS刺激巨噬细胞RAW264.7和Ana-1增殖
2.2.6 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞吞噬中性红
2.2.7 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞释放NO
2.3 实验结果
2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制
2.3.2 乳酸菌胞外多糖含量测定结果
2.3.3 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞的增殖结果
2.3.4 EPS刺激RAW264.7和Ana-1吞噬中性红的结果
2.3.5 EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞释放NO的结果
2.4 分析与讨论
第三章 三种乳杆菌胞外多糖的分离纯化
3.1 材料与设备
3.1.1 菌株和发酵条件
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换纯化
3.2.2 EPS的Sepharose CL-6B分子筛纯化
3.2.3 紫外光谱扫描
3.2.4 红外光谱分析
3.2.5 多角度激光光散射仪测定多糖分子量
3.2.6 离子色谱测定单糖组成
3.3 实验结果
3.3.1 三种EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换纯化结果
3.3.2 三种EPS的Sepharose CL-6B分子筛纯化结果
3.3.3 三种EPS的紫外光谱扫描结果
3.3.4 三种EPS的红外扫描结果
3.3.5 三种EPS的分子量测定结果
3.3.6 三种EPS的单糖组成测定
3.4 分析与讨论
第四章 三种乳杆菌胞外多糖对巨噬细胞免疫活性的影响
4.1 材料与设备
4.1.1 细胞株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.1.4 溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 巨噬细胞RAW264.7和Ana-1的培养
4.2.2 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞增殖
4.2.3 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞吞噬中性红
4.2.4 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞释放NO
4.2.5 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞分泌TNF-α
4.2.6 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞分泌IL-1β
4.2.7 不同浓度EPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞分泌IL-6
4.2.8 巨噬细胞表面标志免疫荧光标记和流式细胞仪检测
4.3 实验结果
4.3.1 不同浓度EPS对巨噬细胞增殖情况检测结果
4.3.2 不同浓度EPS刺激巨噬细胞吞噬中性红能力的检测结果
4.3.3 不同浓度EPS刺激巨噬细胞释放NO的结果
4.3.4 不同浓度EPS刺激巨噬细胞分泌TNF-α的结果
4.3.5 不同浓度EPS刺激巨噬细胞分泌IL-1β的结果
4.3.6 不同浓度EPS刺激巨噬细胞分泌IL-6的结果
4.3.7 SXJ30 EPS刺激巨噬细胞24 h后表面标志表达结果
4.3.8 SXJ30 EPS刺激巨噬细胞48h后表面标志表达结果
4.3.9 SXJ30 EPS刺激巨噬细胞72 h后表面标志表达结果
4.4 分析与讨论
第五章 干酪乳杆菌SXJ30胞外多糖对树突状细胞免疫活性的影响
5.1 材料与设备
5.1.1 实验动物
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器设备
5.1.4 溶液配制
5.2 实验方法
5.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的分离培养
5.2.2 BMDCs表面标志免疫荧光标记和流式细胞仪检测
5.2.3 ELISA检测BMDC上清中TNF-α的含量
5.2.4 ELISA检测BMDC上清中IL-6的含量
5.2.5 ELISA检测BMDC上清中IL-10的含量
5.2.6 ELISA检测BMDC上清中IL-12的含量
5.3 实验结果
5.3.1 小鼠BMDCs培养结果
5.3.2 SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs表面标志表达结果
5.3.3 SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后细胞因子的分泌
5.3.4 SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后IL-10/IL-12的比值
5.4 分析与讨论
第六章 干酪乳杆菌SXJ30胞外多糖增强OVA特异性免疫应答的影响
6.1 材料与设备
6.1.1 实验动物
6.1.2 主要试剂
6.1.3 主要仪器设备
6.2 实验方法
6.2.1 小鼠分组及免疫程序
6.2.2 OVA特异性IgG抗体水平的检测
6.2.3 OVA特异性IgG亚类抗体水平的检测
6.2.4 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖检测
6.2.5 脾脏T淋巴细胞上清中细胞因子的检测
6.2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞胞内因子染色及流式细胞检测
6.2.7 小鼠脾脏树突状细胞表面染色及检测
6.3 实验结果
6.3.1 OVA特异性IgG抗体水平的检测结果
6.3.2 OVA特异性IgG抗体亚类IgG1,IgG2a相IgG2b水平的检测结果
6.3.3 SXJ30 EPS对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力检测结果
6.3.4 SXJ30 EPS对小鼠脾脏T淋巴细胞上清中细胞因子的检测结果
6.3.5 小鼠脾脏T淋巴细胞胞内因子检测结果
6.3.6 SXJ30 EPS刺激小鼠脾脏DCs表面标志表达的结果
6.4 分析与讨论
结论
创新点及展望
1 创新点
2 展望
参考文献
致谢
硕士期间发表论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母细胞壁多糖对肉鸡生长性能、免疫器官发育及盲肠微生物的影响[J]. 贺淼,黄鑫,李彪,胡骏鹏. 饲料工业. 2015(10)
[2]硒化乳酸菌胞外多糖对小鼠腹腔巨噬细胞及肿瘤细胞内游离Ca2+的影响[J]. 刘鹭,潘道东,丁琳,曾小群. 食品科学. 2014(01)
[3]淫羊藿多糖对鸡免疫功能及疫苗免疫效果的影响[J]. 罗燕,邵永斌,谷新利,李星艳. 中国家禽. 2009(01)
[4]乳酸菌胞外多糖分离纯化方法研究进展[J]. 王瑞琼,张红星,熊利霞,易欣欣,刘慧. 食品科学. 2008(08)
[5]M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析[J]. 李康,郭强,王翠妮,陈敏,徐薇,熊思东. 现代免疫学. 2008(03)
[6]苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 王文平,郭祀远,李琳,王明力,梁桂娟. 食品科学. 2007(04)
[7]Exopolysaccharides from Marine Bacteria[J]. CHI Zhenming, and FANG Yan UNESCO Chinese Center of Marine Biotechnology, Ocean University of China, Qingdao 266003, P. R. China. Journal of Ocean University of China. 2005(01)
[8]乳酸菌胞外多糖[J]. 赵玉臣,王迎俊,王忠凤. 中国乳业. 2003(04)
[9]距骨多糖 （APS）和距骨类黄酮 （AF）对活体外正常老鼠细胞和瘤变老鼠细胞的淋巴细胞繁殖及T-淋巴细胞亚群的影响（英文）[J]. 钟鸣,张德山,Murata J,Saiki I,山本格. 四川大学学报(自然科学版). 2001(06)
[10]脂多糖刺激RAW264.7和Ana-1形态改变及细胞因子表达的差异[J]. 石榴,方怡,袁伟锋,李理,黄文杰. 国际呼吸杂志. 2009 (13)
博士论文
[1]植物乳杆菌胞外多糖发酵、结构鉴定及其功能特性研究[D]. 冯美琴.南京农业大学 2012
[2]植物活性多糖对小鼠树突状细胞和巨噬细胞功能的调节作用[D]. 黄丹菲.南昌大学 2009
本文编号：2986162
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