大肠杆菌O157:H7基因缺失株构建及其生物学特性的研究
发布时间：2021-01-22 04:46
大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）O157:H7面临不良环境胁迫时会进入活的不可培养（viable but nonculturable state,VBNC）状态,无法在常规培养基上生长繁殖,从而造成食源性致病菌的漏检,给人类健康造成严重威胁。因此,本课题选取E.coli O157:H7作为研究对象,通过敲除基因技术获得突变株,研究野生株和基因缺陷株进入VBNC状态的差异,及基因缺失导致E.coli O157:H7的生物学特性的改变。研究内容包括三个部分:用Red两步同源重组的方法构建E.coli O157:H7的基因缺陷株,富营养低温诱导E.coli O157:H7基因缺陷株进入VBNC状态,以及探究E.coli O157:H7基因缺陷株的生物学特性。本课题敲除方案:选取可能对E.coli O157:H7 VBNC形成的三个关键基因fimC、luxS和rpoS,运用PCR技术扩增出其两翼与打靶基因上下游同源,中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段。通过电转化的方法,将外源DNA片段转入预先导入质粒pKD46的E.coli O157:H7中。诱导Red重组酶的表达,...
【文章来源】：武汉工程大学湖北省
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1-1两步同源重组的原理
6图 1-2 两步同源重组的质粒图谱a：质粒 pKD46 图谱；b：质粒 pCP20 图谱；C：质粒 pKD4 图谱Figure 1-2 Plasmid map of two-step Red-mediated recombinationa: plasmid map of pKD46; b: plasmid map of pCP20; C: plasmid map of pKD4转录融合的 lacZ 突变株，发现突变株对各自的调控基因都表现出差异，此外，他们还发现鉴于 FLP 重组酶不要求宿主有特异功能，不需要分子克隆，Red 重组系统适用于分析多种生物的基因表达。Zhang等[14]通过两步正负筛选法优化了同源重组的过程，在第一步同源重组时将正负筛选标记插入基因组的特定位置，使用正筛选标记筛选重组
为了去除引入的选择性标记基因——阳性和阴性选择标记基因（sacB），通过将培养基改为鼠李糖来诱导 pREDI 编码的 I-SceI 核酸内在整合的 DNA 片段上存在的 I-SceI 核酸内切酶割，诱导 DSB 修复功能。DSB 介导的两个同组导致插入的缺失盒的去除，产生无标记的基
【参考文献】：
期刊论文
[1]沙门氏菌和单增李斯特菌诱导性耐酸响应机制的研究进展[J]. 田牧雨,张一敏,董鹏程,毛衍伟,梁荣蓉,朱立贤,罗欣. 食品科学. 2019(05)
[2]基因敲除技术研究进展[J]. 丁海峰,李小申,黄慧,苑丽. 黑龙江畜牧兽医. 2018(05)
[3]微生物VBNC状态形成及复苏机制[J]. 张硕,丁林贤,苏晓梅. 微生物学报. 2018(08)
[4]细菌生物被膜的研究进展[J]. 邹明明,王文骏,马晓彬,丁甜,刘东红. 中国食品学报. 2017(07)
[5]Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用[J]. 李鑫,李亚芯,戴建君. 中国畜牧兽医. 2017(07)
[6]食源性致病菌活的不可培养状态研究进展[J]. 钟俊良,魏彩姣,赵喜红. 食品科学. 2017(01)
[7]常见食源性致病菌代谢组学研究进展[J]. 吴清平,李玉冬,张菊梅. 微生物学通报. 2016(03)
[8]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[9]Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用[J]. 吕沈聪,赵颖颖,钟卫鸿. 化学与生物工程. 2013(06)
[10]细菌中RpoS蛋白的表达调控及其功能的研究进展（英文）[J]. 王淑娴,李天保,叶海斌,魏鉴腾,王勇强,刁菁,杨秀生. Agricultural Science & Technology. 2012(06)
博士论文
[1]高压二氧化碳诱导Escherichia coli O157:H7形成活的非可培养状态的机制研究[D]. 赵凤.中国农业大学 2014
硕士论文
[1]两种食源性致病菌VBNC状态诱导与分子检测技术研究[D]. 田聪.华南理工大学 2013
本文编号：2992582
【文章来源】：武汉工程大学湖北省
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1-1两步同源重组的原理
6图 1-2 两步同源重组的质粒图谱a：质粒 pKD46 图谱；b：质粒 pCP20 图谱；C：质粒 pKD4 图谱Figure 1-2 Plasmid map of two-step Red-mediated recombinationa: plasmid map of pKD46; b: plasmid map of pCP20; C: plasmid map of pKD4转录融合的 lacZ 突变株，发现突变株对各自的调控基因都表现出差异，此外，他们还发现鉴于 FLP 重组酶不要求宿主有特异功能，不需要分子克隆，Red 重组系统适用于分析多种生物的基因表达。Zhang等[14]通过两步正负筛选法优化了同源重组的过程，在第一步同源重组时将正负筛选标记插入基因组的特定位置，使用正筛选标记筛选重组
为了去除引入的选择性标记基因——阳性和阴性选择标记基因（sacB），通过将培养基改为鼠李糖来诱导 pREDI 编码的 I-SceI 核酸内在整合的 DNA 片段上存在的 I-SceI 核酸内切酶割，诱导 DSB 修复功能。DSB 介导的两个同组导致插入的缺失盒的去除，产生无标记的基
【参考文献】：
期刊论文
[1]沙门氏菌和单增李斯特菌诱导性耐酸响应机制的研究进展[J]. 田牧雨,张一敏,董鹏程,毛衍伟,梁荣蓉,朱立贤,罗欣. 食品科学. 2019(05)
[2]基因敲除技术研究进展[J]. 丁海峰,李小申,黄慧,苑丽. 黑龙江畜牧兽医. 2018(05)
[3]微生物VBNC状态形成及复苏机制[J]. 张硕,丁林贤,苏晓梅. 微生物学报. 2018(08)
[4]细菌生物被膜的研究进展[J]. 邹明明,王文骏,马晓彬,丁甜,刘东红. 中国食品学报. 2017(07)
[5]Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用[J]. 李鑫,李亚芯,戴建君. 中国畜牧兽医. 2017(07)
[6]食源性致病菌活的不可培养状态研究进展[J]. 钟俊良,魏彩姣,赵喜红. 食品科学. 2017(01)
[7]常见食源性致病菌代谢组学研究进展[J]. 吴清平,李玉冬,张菊梅. 微生物学通报. 2016(03)
[8]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[9]Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用[J]. 吕沈聪,赵颖颖,钟卫鸿. 化学与生物工程. 2013(06)
[10]细菌中RpoS蛋白的表达调控及其功能的研究进展（英文）[J]. 王淑娴,李天保,叶海斌,魏鉴腾,王勇强,刁菁,杨秀生. Agricultural Science & Technology. 2012(06)
博士论文
[1]高压二氧化碳诱导Escherichia coli O157:H7形成活的非可培养状态的机制研究[D]. 赵凤.中国农业大学 2014
硕士论文
[1]两种食源性致病菌VBNC状态诱导与分子检测技术研究[D]. 田聪.华南理工大学 2013
本文编号：2992582
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