胶质细胞源性神经营养因子参与卵泡颗粒细胞增殖的作用研究

发布时间：2017-04-11 18:12

  本文关键词：胶质细胞源性神经营养因子参与卵泡颗粒细胞增殖的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是1993年Lin等发现的一种新的有活性的神经营养因子,近年来,让生殖届学者感兴趣的是,GDNF不仅可以在外周器官中表达,且有证据表明其表达量高于中枢神经系统,其中更是以卵巢中的表达水平由为突出。在睾丸组织中的表达亦是十分的显著。卵巢中的神经不仅和血管相连,也和卵泡相连接,同时可以发现异位移植的卵巢组织迅速的长出神经纤维。GDNF在卵巢组织中高表达,且分布泌尿系统和成年个体的卵巢中且贯穿整个胚胎发育阶段,主要集中在卵泡的颗粒细胞上。小鼠GDNF的mRNA表达水平随着卵泡的发育逐渐的变显著,直到排卵前达到最高峰。基于上述情况,小鼠GDNF基因蛋白主要分布于卵子和颗粒细胞以及间质细胞上。Kawamura等人进行了一项DNA微阵列分析的实验,也证实了在小鼠中DGNF的重要作用,后续的实验表明GDNF的小鼠卵巢中广泛表达,在卵丘细胞,颗粒细胞和细胞膜细胞中均有表达。无论是新生小鼠还是成年小鼠的卵巢中均有GDNF的]mRNA的表达,贯穿整个的发育阶段,主要集中在卵泡中的卵子的间质细胞中,在窦卵泡的卵丘细胞,颗粒细胞和细胞膜细胞中也均有表达。从经历卵母细胞体外成熟培养(IVM)的妇女的卵母细胞的实验观察发现,在卵泡成熟的最后阶段内GDNF蛋白在卵巢内的表达范围是扩大的,主要分布在未受刺激的的颗粒细胞中。逐步的,通过人和各种哺乳动物中所获得数据配对,我们可以总结出GDNF及其受体的表达模式,在成年女性／雌性卵巢内GDNF以旁分泌和自分泌的方式影响卵母细胞和卵丘细胞。虽然对于GDNF在生殖方面的研究已经较多,但是人卵巢方面的研究却仍然很少,有证据表明人黄素化颗粒细胞核及细胞浆内存在GDNF, GFRa-1,Ret的表达,且FHS和hCG可以增加颗粒细胞中的GDNF的表达,并且以旁分泌的方式促进卵泡成熟。在卵巢组织体外培养的过程中,加入GDNF可以促进卵泡的发育和成熟,然而对于GDNF作用于颗粒细胞以及卵母细胞各自的机制如何?本研究以KGN颗粒细胞和人卵母细胞为研究对象,检测GDNF及其受体在人卵母细胞内的表达情况,观察GDNF刺激对KGN颗粒细胞体外培养所起到的作用,并初步探讨其在作用机制。目的观察(GDNF对冻融后人腔前卵泡来源的卵母细胞体外发育的作用；探讨GDNF在KGN细胞增殖过程中影响,以及GDNF刺激后KGN细胞基因表达的变化,为临床应用提供有利的理论和实验依据。方法1.搜集卵巢囊肿手术患者的正常卵巢皮质,采用玻璃化冷冻的方法行冷冻处理,解冻后行酶消化法消化,消化后机械法于镜下取始基卵泡和初级卵泡,置于FA凝胶内,GDNF刺激,选择适当浓度,观察GDNF刺激后体外培养卵泡变化。2体外培养KGN细胞,于6孔皿传代后24h,行饥饿处理6h后,给予1ul含GDNF试剂至试验组使GDNF浓度为5ul/ml,6h后裂解细胞并提取RNA,做PCR,检测基因变化。3.体外培养KGN细胞,传代入12孔皿后,行爬片处理,采用免疫组化和RT-PCR法检测其受体GDNF家族受体酪氨酸激酶受体RET (rearranged during transfeetion)的表达。4.体外培养KGN细胞,传代入96孔皿后,分别给予不同浓度GDNF刺激,观察24h、48h后做CCK-8刺激后细胞增殖情况。5.体外培养KGN细胞,于6孔皿传代后,试验组给予5ng/ml GDNF刺激,24h,48h后分别收集试验组和控制组液体lml,检测2组间雌激素、孕激素变化。结果1.酶+机械法联合分离卵泡后置于FA凝胶中,给予不同浓度的GDNF刺激,在体外培养6天时,10ng/mlGDNF组和100ng/mlGDNF组中卵泡直径及分泌的E2水平增长显著高于对照组和1ng/mlGDNF组(P0.05)。2.GDNF的受体蛋白RET在颗粒细胞上有表达,定位于胞核和胞浆。3.不同浓度水平的GDNF对颗粒细胞系的生长影响不同：高浓度的GDNF抑制细胞增殖,低浓度的GDNF促进细胞增殖。其中100ng/ml较控制组显著抑制(P0.05),10ng/ml组则较控制组显著促进增殖(P0.05)。4.10ng/mlGDNF处理KGN细胞后对颗粒细胞的雌孕激素没有显著影响(P0.05)。5.FSH及其受体mRNA在10ng/mlGDNF刺激后表达有改变,表达量提高(P0.05)。结论1.在体外培养液中添加10 ng/ml和100ng/ml GDNF有利于促进分离后人腔前卵泡的体外生长发育,提高E2分泌功能。2. GDNF受体RET的mRNA在KGN细胞中有表达,定位于胞核和细胞浆。3.10ng/mlGDNF可以更好的刺激体外培养KGN细胞增殖,而其浓度过大可抑制细胞增殖。4.GDNF体外刺激KGN细胞,雌激素孕激素水平无显著变化。5.GDNF体外刺激KGN细胞,可以改变其下游基因FSH受体表达的改变,增加FSH敏感性。
【关键词】：GDNF KGN细胞 细胞增殖
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 中英文缩略词表12-14
• 前言14-17
• 1 材料与方法17-32
• 2 结果32-37
• 3 讨论37-41
• 4 结论41-42
• 附图42-44
• 参考文献44-48
• 综述 胶质细胞源性神经营养因子及其在生殖领域的研究进展48-65
• 参考文献58-65
• 个人简历65-66
• 攻读学位期间发表论文及参加会议情况及参与课题情况66-67
• 致谢67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孙文枫;苏迎春;孙莹璞;郭艺红;刘新贵;马新想;冯双苗;;冷冻保存对人卵巢组织雌二醇分泌功能的影响[J];生殖与避孕;2009年06期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 马莉;冻融人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养的研究[D];郑州大学;2011年

  本文关键词：胶质细胞源性神经营养因子参与卵泡颗粒细胞增殖的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：299666