重要海洋病原细菌迟钝爱德华氏菌感染小鼠及细胞的研究模型建立

发布时间：2017-04-11 19:12

  本文关键词：重要海洋病原细菌迟钝爱德华氏菌感染小鼠及细胞的研究模型建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：虽然迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的鱼类病原细菌,但据国内外文献报道,E. tarda同时也能感染鸟类、爬行类、哺乳类等高等脊椎动物,甚至人类。因此,成功建立迟钝爱德华氏菌感染小鼠及其相关细胞的模型至关重要,这可以为我们深入考察病原菌和宿主之间的相互作用奠定基础,帮助我们开发出用来防治迟钝爱德华氏菌的有效药物和疫苗。同时,由于鱼类和哺乳动物的免疫系统具有较高的相似性,我们还可以借助小鼠模型来弥补一些鱼类模型上的技术弊端,使得我们利用更多实验技术手段更深层次地探讨病原菌或疫苗与宿主之间的相互关系。 本课题首先探索建立了迟钝爱德华氏菌野生株EIB202感染小鼠的实验模型,分析了不同感染途径下小鼠体内细菌数变化、小鼠发病率、半数致死剂量(LDs0)、小鼠发病症状,结果表明：野生株EIB202能使小鼠感染并使其发病或死亡。基于上述小鼠的感染模型,我们比较了迟钝爱德华氏菌EIB202的III型分泌系统(TTSS)缺失株和Ⅵ型分泌系统(T6SS)基因缺失株的感染治病情况,结果表明TTSS和T6SS是细菌感染小鼠模型的关键致病因子。此外,我们建立了小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)、骨髓来源中性粒细胞(PMN)以及多种小鼠原代组织上皮细胞的分离培养及鉴定方法。基于上述小鼠细胞模型,我们进行了迟钝爱德华氏菌EIB202的细胞感染实验,结果表明：EIB202在巨噬细胞模型上能诱导产生炎症小体及细胞焦亡,而且经巨噬细胞调理的EIB202对于小鼠原代组织上皮细胞具有显著增强的致病性。此外,EIB202在感染前期能被小鼠中性粒细胞有效杀伤或抑制。 本研究建立了迟钝爱德华氏菌感染小鼠及相关细胞的研究模型,为深入研究该病原菌与宿主相互作用机制打下了基础。
【关键词】：迟钝爱德华氏菌 小鼠 细胞 感染模型
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R-332
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 文献综述11-20
• 1.1 迟钝爱德华氏菌11
• 1.2 小鼠作为感染模型的研究11-13
• 1.3 小鼠来源的细胞作为模型的研究13-19
• 1.3.1 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)分离鉴定及相关研究13-15
• 1.3.2 小鼠中性粒细胞研究15-17
• 1.3.3 传代细胞模型研究17-18
• 1.3.4 小鼠组织器官原代细胞分离及相关研究18-19
• 1.4 本课题研究内容及意义19-20
• 第2章 迟钝爱德华氏菌野生株EIB202感染小鼠的研究20-35
• 2.1 前言20
• 2.2 实验材料20-21
• 2.2.1 细菌及实验动物20
• 2.2.2 主要实验试剂与缓冲液20
• 2.2.3 培养基20-21
• 2.2.4 主要实验器材及仪器设备21
• 2.3 实验方法21-23
• 2.3.1 不同注射方式、不同注射剂量下小鼠存活率21-22
• 2.3.2 EIB202半数致死量(LD_(50))计算22
• 2.3.3 EIB202感染动力学研究22-23
• 2.3.4 小鼠感染病症23
• 2.3.5 冷冻组织切片和病理组织切片23
• 2.4 实验结果23-33
• 2.4.1 不同注射方式、不同注射剂量下小鼠存活率统计23-24
• 2.4.2 小鼠半数致死量测定结果24-26
• 2.4.3 迟钝爱德华氏菌EIB202感染动力学结果26-27
• 2.4.4 EIB202对小鼠致病性表现27-30
• 2.4.5 冷冻组织切片和病理组织切片分析30-33
• 2.5 讨论33-34
• 2.6 结论34-35
• 第3章 迟钝爱德华氏菌各种突变株感染小鼠的研究35-41
• 3.1 前言35-36
• 3.2 实验材料36
• 3.2.1 细菌及实验动物36
• 3.2.2 主要实验试剂与缓冲液36
• 3.2.3 培养基36
• 3.2.4 主要实验器材及仪器设备36
• 3.3 实验方法36-37
• 3.3.1 TTSS相关基因缺失株感染小鼠动力学考查36-37
• 3.3.2 T6SS相关基因缺失株小鼠体内早期定植能力考查37
• 3.3.3 △evpP菌株在小鼠体内感染动力学37
• 3.4 实验结果37-39
• 3.4.1 TTSS相关基因缺失株感染小鼠动力学结果37-38
• 3.4.2 T6SS相关基因缺失株小鼠体内早期定植能力38-39
• 3.4.3 △evpP菌株在小鼠体内感染动力学结果39
• 3.5 讨论39-40
• 3.6 结论40-41
• 第4章 EIB202感染小鼠BMDM模型的研究41-57
• 4.1 前言41
• 4.2 实验材料41-42
• 4.2.1 细菌、细胞株及实验动物41
• 4.2.2 主要实验试剂与缓冲液41-42
• 4.2.4 主要实验器材及仪器设备42
• 4.3 实验方法42-50
• 4.3.1 骨髓来源巨噬细胞BMDM分离及培养42-46
• 4.3.2 EIB202对BMDM的黏附及内化能力考察46
• 4.3.3 EIB202刺激BMDM产生炎症小体情况46-48
• 4.3.4 细胞焦亡情况48
• 4.3.5 小鼠血清中IL-1β测定48-50
• 4.4 实验结果50-56
• 4.4.1 L929细胞及BMDM分离、分化增殖结果50-52
• 4.4.2 BMDM流式细胞仪鉴定结果52-53
• 4.4.3 EIB202对BMDM的黏附率和内化率53-54
• 4.4.4 炎症小体激活及焦亡结果54-55
• 4.4.5 EIB202使小鼠在早期产生炎症小体55-56
• 4.5 讨论56
• 4.6 结论56-57
• 第5章 EIB202感染中性粒细胞(PMN)模型的研究57-65
• 5.1 前言57
• 5.2 实验材料57-58
• 5.2.1 细菌、细胞株及实验动物57
• 5.2.2 主要实验试剂与缓冲液57
• 5.2.3 培养基57
• 5.2.4 主要实验器材及仪器设备57-58
• 5.3 实验方法58-61
• 5.3.1 中性粒细胞分离培养58-60
• 5.3.2 PMN杀菌实验60-61
• 5.4 实验结果61-63
• 5.4.1 两种PMN分离方法比较61-62
• 5.4.2 PMN对EIB202吞噬及杀菌作用62-63
• 5.4.3 PMN对EIB202及其突变株杀菌作用比较63
• 5.5 讨论63-64
• 5.6 结论64-65
• 第6章 巨噬细胞调理的EIB202感染小鼠组织原代细胞的研究65-74
• 6.1 前言65
• 6.2 实验材料65-66
• 6.2.1 细菌、细胞株及实验动物65
• 6.2.2 主要实验试剂与缓冲液65-66
• 6.2.3 培养基66
• 6.2.4 主要实验器材及仪器设备66
• 6.3 实验方法66-68
• 6.3.1 原代细胞分离培养66-67
• 6.3.2 巨噬细胞系调理的EIB202(Escaped EIB202)侵染组织原代细胞实验67-68
• 6.3.3 荧光显微镜观察细菌侵染能力68
• 6.4 实验结果68-73
• 6.4.1 细胞分离及培养结果68-72
• 6.4.2 侵染原代组织细胞结果72-73
• 6.5 讨论73
• 6.6 结论73-74
• 第7章 结论、创新点与展望74-75
• 7.1 结论74
• 7.2 创新点74
• 7.3 展望74-75
• 参考文献75-81
• 致谢81

【参考文献】

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