大肠杆菌体内和体外表达HIV-1 gp41重组抗原及其免疫反应性检测

发布时间：2017-04-12 18:19

  本文关键词：大肠杆菌体内和体外表达HIV-1 gp41重组抗原及其免疫反应性检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,HIV病毒在全球范围内呈现快速流行态势。HIV抗体诊断试剂作为目前初步诊断HIV的主要方法,具有巨大的市场价值。随着生物技术的发展,利用基因工程的手段,制备具有良好免疫反应性的HIV-1 gp41重组抗原原料,对于HIV抗体诊断试剂的研发有着深远意义。本文首先合成了经过密码子优化的gp41基因质粒模板pET-28a(+)-gp41,PCR扩增获得了包含gp41主要优势抗原表位以及膜外重要结构域(NHR、CHR、 MPER)的截短基因序列。通过在gp41截短片段上游添加亲水性分子伴侣DsbA,在大肠杆菌体内实现了gp41优势抗原表位蛋白的融合表达。在优化表达条件下(37℃,0.2 mM IPTG,诱导后培养时间10 h),融合蛋白表达水平为8.7 μg/mL鉴于gp41融合蛋白在大肠杆菌体内表达的水平较低,无法满足制备gp41抗原的要求,本研究进而利用大肠杆菌体外无细胞体系表达gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全长基因,成功构建无细胞表达重组质粒pIVEX2.4c-gp41,在大肠杆菌无细胞体系中实现了gp41全长蛋白的表达。进一步考察去污剂重悬目标蛋白和直接在无细胞体系中添加去污剂两种模式对获得可溶gp41蛋白的影响。结果显示,所尝试的各种去污剂均不能有效重悬gp41蛋白沉淀；而直接添加去污剂模式在最优条件下(添加终浓度为0.2%的Brij78),可溶gp41蛋白的表达水平达到650μg/mL。对添加去污剂模式所表达的可溶gp41重组蛋白进行纯化、浓缩和替换缓冲液,蛋白纯度达到95.6%,浓度为1.5 mg/mL,总回收率为70%。利用纯化后的gp41重组蛋白制备乳胶法免疫层析试纸,通过对不同抗体滴度HIV-1阳性标本、HIV-1阴性标本、TP阳性标本以及HBeAb阳性标本的检测,证明该gp41重组蛋白免疫反应性良好。总之,本文致力于HIV-1 gp41在大肠杆菌体内和体外无细胞体系的重组表达研究。通过对无细胞表达体系的优化,实现了gp41的全长可溶表达,亲和纯化获得的目标蛋白经乳胶法试纸评估具有免疫反应性。本研究为HIV抗体诊断试剂的研发提供了具有潜在应用价值的gp41抗原。
【关键词】：人类免疫缺陷病毒 跨膜蛋白gp41 融合表达 无细胞体系 去污剂 乳胶法试纸 免疫反应性
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-15
• 第一章 绪论15-35
• 1.1 引言15
• 1.2 人类免疫缺陷病毒HIV15-25
• 1.2.1 HIV的发现15-17
• 1.2.2 HIV的形态结构17-18
• 1.2.3 HIV的基因组结构18-20
• 1.2.4 HIV入侵细胞的机制和致病机理20-21
• 1.2.5 HIV的分型及分布21-23
• 1.2.6 全球艾滋病流行现状23-25
• 1.3 HIV-1跨膜蛋白gp4125-29
• 1.3.1 HIV-1 gp41的结构和功能25-27
• 1.3.2 HIV-1 gp41的抗原表位27-28
• 1.3.3 gp41在HIV诊断检测中的应用28-29
• 1.4 膜蛋白表达研究的策略29-33
• 1.4.1 体内融合表达策略30
• 1.4.2 体外无细胞体系表达策略30-33
• 1.5 本课题的基本思路和研究内容33-35
• 第二章 材料与方法35-43
• 2.1 实验材料35-38
• 2.1.1 实验菌株35
• 2.1.2 质粒35
• 2.1.3 主要试剂及工具酶35-36
• 2.1.4 培养基36
• 2.1.5 分子生物学实验溶液配制36-37
• 2.1.6 主要仪器37-38
• 2.2 实验方法38-43
• 2.2.1 分子克隆实验38-40
• 2.2.2 细胞密度的测定40
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳40
• 2.2.4 Western blotting分析40-41
• 2.2.5 大肠杆菌无细胞体系抽提物的制备41-43
• 第三章 HIV-1 gp41在大肠杆菌体内的截短融合表达43-55
• 3.1 引言43-44
• 3.2 实验材料44
• 3.2.1 菌株与质粒44
• 3.2.2 试剂及工具酶44
• 3.3 实验方法44-48
• 3.3.1 模板合成及目的基因选择44-45
• 3.3.2 引物设计45-46
• 3.3.3 PCR扩增目的基因46
• 3.3.4 融合表达载体的构建46-47
• 3.3.5 大肠杆菌体系诱导表达gp41融合蛋白47
• 3.3.6 细胞破碎47
• 3.3.7 SDS-PAGE与Western blotting47-48
• 3.4 结果与讨论48-54
• 3.4.1 gp41截短基因的扩增48
• 3.4.2 pET-39b(+)-gp41-T融合表达载体的构建48-49
• 3.4.3 gp41融合蛋白的诱导表达49-51
• 3.4.4 诱导温度对gp41融合蛋白表达的影响51-52
• 3.4.5 IPTG浓度对gp41融合蛋白表达的影响52-53
• 3.4.6 诱导后培养时间对gp41融合蛋白表达的影响53-54
• 3.5 本章小结54-55
• 第四章 HIV-1 gp41在大肠杆菌体外无细胞体系的高效表达55-71
• 4.1 引言55
• 4.2 实验材料55-56
• 4.2.1 菌株与质粒55-56
• 4.2.2 试剂及工具酶56
• 4.3 实验方法56-60
• 4.3.1 引物设计56
• 4.3.2 目的基因的克隆56
• 4.3.3 无细胞重组表达载体的构建56-57
• 4.3.4 制备大肠杆菌无细胞体系抽提物57
• 4.3.5 大肠杆菌无细胞反应体系配置57-59
• 4.3.6 无细胞体系表达gp4159
• 4.3.7 去污剂重悬无细胞体系表达的膜蛋白沉淀(P-CF模式)59
• 4.3.8 无细胞体系添加去污剂可溶表达gp41(D-CF模式)59-60
• 4.3.9 SDS-PAGE60
• 4.4 结果与讨论60-69
• 4.4.1 gp41全长基因的克隆60-61
• 4.4.2 pIVEX2.4c-gp41无细胞表达载体的构建61-62
• 4.4.3 gp41蛋白的无细胞体系表达62-63
• 4.4.4 去污剂重悬表达可溶性gp4163-64
• 4.4.5 直接在无细胞体系添加去污剂表达可溶性gp4164-66
• 4.4.6 Brij78浓度对无细胞体系可溶性表达gp41的影响66-67
• 4.4.7 反应时间对无细胞体系可溶表达gp41的影响67-68
• 4.4.8 无细胞体系两种表达可溶性gp41模式的比较68-69
• 4.5 本章小结69-71
• 第五章 gp41重组蛋白的分离纯化及其免疫反应性的初步检测71-81
• 5.1 引言71-72
• 5.2 实验材料72
• 5.2.1 质粒72
• 5.2.2 试剂72
• 5.3 实验方法72-75
• 5.3.1 可溶性gp41的制备表达72
• 5.3.2 Ni-NTA亲和层析纯化gp4172-73
• 5.3.3 纯化后蛋白的浓缩和缓冲液替换73-74
• 5.3.4 蛋白浓度的测定74
• 5.3.5 SDS-PAGE74
• 5.3.6 乳胶法试纸的制备74
• 5.3.7 gp41重组蛋白的反应性检测74
• 5.3.8 gp41重组蛋白的灵敏度检测74-75
• 5.3.9 gp41重组蛋白的特异性检测75
• 5.4 结果与讨论75-79
• 5.4.1 gp41重组蛋白的纯化75-76
• 5.4.2 gp41重组蛋白的浓缩和替换缓冲液76
• 5.4.3 gp41重组蛋白的反应性检测76-77
• 5.4.4 gp41重组蛋白的灵敏度检测77-78
• 5.4.5 gp41重组蛋白的特异性检测78-79
• 5.5 本章小结79-81
• 第六章 结论与展望81-85
• 6.1 结论81-82
• 6.2 展望82-85
• 参考文献85-99
• 作者简介99

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