HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

发布时间：2021-02-09 05:04

　　目的制备人乳头瘤病毒（HPV）16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a（+）载体,构建pET21a（+）/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a（+）/HPV16 E6转化至E.coli BL21（DE3）中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体, ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a（+）/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a（+）/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21（DE3）后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40 000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论... 

【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2020,36(03)北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

重组质粒的构建及鉴定

将测序正确的重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至E. coli BL21 (DE3)菌株中。经1 mmol/L IPTG诱导表达, SDS-PAGE分离后, 可见Mr 14 000处出现较浓的诱导条带, 与理论值大小一致(图3A)。超声裂解后进行SDS-PAGE分析, 发现重组蛋白在沉淀中, 以包涵体形式表达(图3B)。通过6 mol/L盐酸胍溶解, Ni-NTA亲和层析纯化, 在Mr 14 000 处出现明显单一的蛋白条带(图3C)。以小鼠抗 His-tag mAb为一抗(1∶5000)进行Western blot法分析, 在Mr 14 000处可见阳性单一反应条带(图3D)。2.3 兔抗HPV16 E6抗体效价为1∶40 000

纯化重组蛋白HPV16 E6透析复性后, 以10 μg/mL终浓度包被酶标板, 间接 ELISA 法检测兔0、 2、 4、 6、 8周抗HPV16 E6兔血清特异性IgG型抗体。结果显示, HPV16E重组蛋白免疫后第2周开始产生特异性抗体, 至第8周达到高峰(图4A) 。取8周血清进行抗体稀释滴度检测, 结果显示, HPV16 E6兔多克隆抗体的血清效价可达1∶40 000(图4B)。2.4 制备的HPV16 E6兔多克隆抗体可特异性识别纯化的HPV16 E6重组蛋白

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3025094