荧光素酶标记的重组人3型腺病毒的构建及分析
发布时间：2021-02-10 12:12
人3型腺病毒在人DSG2受体转基因鼠体内复制及侵染等生命过程尚不清楚。本研究旨在构建含萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase,Fluc）报告基因的复制型重组人3型腺病毒,为可视化重组人3型腺病毒的应用奠定基础。通过PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭质粒pSKA3E3LR（EGFP）,经双酶切后与人3型腺病毒骨架质粒pBRAd3-EGFP的PCR扩增片段经重组酶Exnase体外重组的方法,得到中间载体,最后与pBRAd3-EGFP酶切片段连接,得到重组腺病毒质粒pAd3-LUC;转染AD293细胞,将包装成功的重组腺病毒rAd3-LUC纯化并免疫动物,分析重组腺病毒的特性和在小鼠体内的免疫反应。结果显示采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到重组人3型腺病毒质粒pAd3-LUC,线性化的pAd3-LUC转染AD293细胞包装拯救得到重组腺病毒rAd3-LUC,观察到细胞病变和检测到荧光素酶的稳定表达,rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以识别并中和重组腺病毒rAd3-LUC（滴度约128～256）。本研究成功构建了E3区缺失并嵌入荧光素酶的...
【文章来源】：病毒学报. 2020,36(04)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
重组克隆pAd3-LUC的构建策略
用HAdV‐3的hexon基因的特异引物对（Hexon‐AdV3‐F/Hexon‐AdV3‐R）以及荧光素酶基因的特异引物对（Luc2u/Luc2r）进行PCR鉴定（图3A、3B），并且测序结果显示，正确的荧光素酶基因插入重组腺病毒内，EGFP基因被成功替换。将阳性克隆pAd3‐LUC抽提质粒后，用内切酶Bam HI单酶切以及Xba I和Not I双酶切鉴定（图3C），并与理论酶切图谱（图3D）比较，结果证实获得基因组正确的阳性重组克隆pAd3‐LUC。3重组腺病毒质粒pAd3-LUC的包装和纯化
测序和酶切鉴定为阳性的重组腺病毒质粒经内切酶Asi SI酶切线性化后，用Liopfectamine?3000转染试剂转染AD293细胞，培养5～8d。连续盲传4代后出现CPE，第五代后CPE典型，提取重组腺病毒基因组进行PCR扩增确定含有荧光素酶基因，并测序证明荧光素酶基因仍正确插入重组人3型腺病毒。荧光显微镜下观察并没有发现绿色荧光，说明EGPF基因基本被切除。拯救得到的重组腺病毒rAd3‐LUC大量培养（30～40个100mm皿）后进行CsCl不连续密度梯度离心纯化，获得约9.2×1012VPs重组腺病毒粒子。纯化的重组腺病毒rAd3‐LUC进行SDS‐PAGE检测分析（图4），病毒hexon蛋白条带正常。4重组腺病毒rAd3-LUC的特性分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用[J]. 李振海,吴红平,徐增辉,吕赛群,施军霞,刘品一,李林芳,金华君,吴孟超,钱其军. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2015(04)
[2]活体成像系统检测携荧光素酶增殖缺陷型腺病毒在小鼠体内的表达和分布[J]. 孟希亭,林晨,梅佳,王海娟,马飞,张金龙,张颖,钱海利. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2011(04)
[3]活体生物发光成像技术及其在病毒感染研究中的应用[J]. 柴凡,周耘裔,肖庚富. 微生物学报. 2011(04)
[4]带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达[J]. 陈坚,薛绪潮,方国恩,苏长青,钱其军. 第四军医大学学报. 2008(15)
[5]《分子克隆实验指南》（第3版）[J]. 李载平. 科学通报. 2002(24)
本文编号：3027340
【文章来源】：病毒学报. 2020,36(04)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
重组克隆pAd3-LUC的构建策略
用HAdV‐3的hexon基因的特异引物对（Hexon‐AdV3‐F/Hexon‐AdV3‐R）以及荧光素酶基因的特异引物对（Luc2u/Luc2r）进行PCR鉴定（图3A、3B），并且测序结果显示，正确的荧光素酶基因插入重组腺病毒内，EGFP基因被成功替换。将阳性克隆pAd3‐LUC抽提质粒后，用内切酶Bam HI单酶切以及Xba I和Not I双酶切鉴定（图3C），并与理论酶切图谱（图3D）比较，结果证实获得基因组正确的阳性重组克隆pAd3‐LUC。3重组腺病毒质粒pAd3-LUC的包装和纯化
测序和酶切鉴定为阳性的重组腺病毒质粒经内切酶Asi SI酶切线性化后，用Liopfectamine?3000转染试剂转染AD293细胞，培养5～8d。连续盲传4代后出现CPE，第五代后CPE典型，提取重组腺病毒基因组进行PCR扩增确定含有荧光素酶基因，并测序证明荧光素酶基因仍正确插入重组人3型腺病毒。荧光显微镜下观察并没有发现绿色荧光，说明EGPF基因基本被切除。拯救得到的重组腺病毒rAd3‐LUC大量培养（30～40个100mm皿）后进行CsCl不连续密度梯度离心纯化，获得约9.2×1012VPs重组腺病毒粒子。纯化的重组腺病毒rAd3‐LUC进行SDS‐PAGE检测分析（图4），病毒hexon蛋白条带正常。4重组腺病毒rAd3-LUC的特性分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用[J]. 李振海,吴红平,徐增辉,吕赛群,施军霞,刘品一,李林芳,金华君,吴孟超,钱其军. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2015(04)
[2]活体成像系统检测携荧光素酶增殖缺陷型腺病毒在小鼠体内的表达和分布[J]. 孟希亭,林晨,梅佳,王海娟,马飞,张金龙,张颖,钱海利. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2011(04)
[3]活体生物发光成像技术及其在病毒感染研究中的应用[J]. 柴凡,周耘裔,肖庚富. 微生物学报. 2011(04)
[4]带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达[J]. 陈坚,薛绪潮,方国恩,苏长青,钱其军. 第四军医大学学报. 2008(15)
[5]《分子克隆实验指南》（第3版）[J]. 李载平. 科学通报. 2002(24)
本文编号：3027340
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