具备定点偶联功能的HBc-VLPs的制备与性质鉴定
发布时间：2021-03-02 07:10
乙型肝炎病毒核心蛋白HBc,可在体外自组装形成二十面体对称结构的病毒样微粒VLPs。VLPs可将外源序列重复且高密度地展示在表面,VLPs进入机体后能够快速诱导机体产生针对外源性抗原的特异性体液免疫及细胞免疫应答,具有极强的免疫原性与生物活性。因此,HBc-VLPs可以作为一种安全、有效的疫苗载体。文中设计了一种能够实现与抗原定点偶联的HBc-VLPs,并开发了一套高效制备HBc-VLPs的方法。通过定点突变技术,使翻译后的多肽序列第80位氨基酸由Ala变为Cys,在HBc-VLPs的主要免疫显性区域引入一个定点交联位点,构建了原核表达载体pET28a（+）-hbc,表达、纯化获得了高纯度的HBc（A80C）单体蛋白;在PB缓冲体系中,HBc（A80C）蛋白自组装形成HBc-VLPs纳米粒子。粒度仪的测定结果表明,HBc-VLPs纳米微粒的平均粒径为29.8 nm,透射电子显微镜观察到HBc-VLPs形成粒径约为30 nm的球形微粒,其形态与天然的HBV微粒相似。以流感病毒M2e抗原肽为模式抗原,通过Sulfo-SMCC氨基-巯基双功能交联剂,将M2e定点连接于HBc-VLPs通过突变...
【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(07)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
pET28a(+)-hbc重组质粒的构建
选取6–8周龄的BALB/c雌性小鼠，随机分配到笼内，每组6只。将M2e-HBc-VLPs、未交联的M2e抗原肽分别对不同组内的小鼠进行皮下注射，根据实验设计50μg或100μg/只，空白对照组注射相同体积的无抗原缓冲液作为阴性对照。初次免疫后，间隔2周免疫1次，共免疫3次。动物实验依照3R原则，并给予相应的人道关怀。1.1 0 免疫动物血清中抗原特异抗体的检测
以公司合成的包含hbc基因完整序列的质粒为模板，用相应的引物进行点突变并扩增hbc基因序列，重叠延伸PCR反应结束后扩增出两条明亮、单一的条带，电泳结果如图3所示，在500 bp附近处出现单一、明亮的条带，这与理论大小469 bp(含酶切位点与保护碱基)相符，扩增序列正确。经过酶切、连接、转化等步骤后，菌液PCR验证目标序列的载入，测序显示载入序列与理论序列完全一致，序列中238–240位已从GCA突变为TGT，说明重组质粒pET-28a(+)-hbc构建成功。在重组载体设计之初，我们就将表达HBc蛋白C末端150–183位氨基酸的基因序列除去，仅保留了1–149位氨基酸的基因序列。研究表明150–183位氨基酸对颗粒的形成和衣壳的大小与形态的维持是非必需的，除去HBc蛋白C末端含有病毒衣壳RNA/DNA结合位点的150–183残基序列，能够防止RNA/DNA与病毒衣壳结合[21]，且大多数149残基衣壳肽链经大肠杆菌表达都会组装形成T=4型微粒[22]。这样的设计保证了颗粒的均一性，并且T=4型微粒的结构与天然的HBV衣壳一致。在HBc肽链的1–149位氨基酸中含有3个半胱氯酸残基，位置分别位于48、61、107位。48位Cys与61位Cys通常参与链间二硫键的形成，107位Cys被埋藏于核心颗粒的内部[23],3个位点都不是抗原肽结合的最佳位置。而78–82位氨基酸位于病毒微粒表面突起的顶部，是HBc的主要免疫显性区域[17]，是抗原肽交联的最佳区域，因此，选取此区域引入半胱氨酸残基。78位到82位的氨基酸分别为78天冬氨酸(Asp)、79脯氨酸(Pro)、80丙氨酸(Ala)、81丝氨酸(Ser)、82精氨酸(Arg)，通过分析5个氨基酸的理化性质，以及氨基酸改变后对蛋白结构的影响，将80位丙氨酸变为半胱氨酸带来的结构改变最小，是最佳的选择(图4)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]由乙肝病毒核心蛋白（HBc-VLP）递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究[J]. 张旭凡,胡发彪,马兴元,王天文,王平,王晓丽. 中国生物工程杂志. 2016(02)
[2]M2e-HBC融合蛋白的真核表达[J]. 刘蕊,李志奎. 陕西医学杂志. 2011(09)
本文编号：3058853
【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(07)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
pET28a(+)-hbc重组质粒的构建
选取6–8周龄的BALB/c雌性小鼠，随机分配到笼内，每组6只。将M2e-HBc-VLPs、未交联的M2e抗原肽分别对不同组内的小鼠进行皮下注射，根据实验设计50μg或100μg/只，空白对照组注射相同体积的无抗原缓冲液作为阴性对照。初次免疫后，间隔2周免疫1次，共免疫3次。动物实验依照3R原则，并给予相应的人道关怀。1.1 0 免疫动物血清中抗原特异抗体的检测
以公司合成的包含hbc基因完整序列的质粒为模板，用相应的引物进行点突变并扩增hbc基因序列，重叠延伸PCR反应结束后扩增出两条明亮、单一的条带，电泳结果如图3所示，在500 bp附近处出现单一、明亮的条带，这与理论大小469 bp(含酶切位点与保护碱基)相符，扩增序列正确。经过酶切、连接、转化等步骤后，菌液PCR验证目标序列的载入，测序显示载入序列与理论序列完全一致，序列中238–240位已从GCA突变为TGT，说明重组质粒pET-28a(+)-hbc构建成功。在重组载体设计之初，我们就将表达HBc蛋白C末端150–183位氨基酸的基因序列除去，仅保留了1–149位氨基酸的基因序列。研究表明150–183位氨基酸对颗粒的形成和衣壳的大小与形态的维持是非必需的，除去HBc蛋白C末端含有病毒衣壳RNA/DNA结合位点的150–183残基序列，能够防止RNA/DNA与病毒衣壳结合[21]，且大多数149残基衣壳肽链经大肠杆菌表达都会组装形成T=4型微粒[22]。这样的设计保证了颗粒的均一性，并且T=4型微粒的结构与天然的HBV衣壳一致。在HBc肽链的1–149位氨基酸中含有3个半胱氯酸残基，位置分别位于48、61、107位。48位Cys与61位Cys通常参与链间二硫键的形成，107位Cys被埋藏于核心颗粒的内部[23],3个位点都不是抗原肽结合的最佳位置。而78–82位氨基酸位于病毒微粒表面突起的顶部，是HBc的主要免疫显性区域[17]，是抗原肽交联的最佳区域，因此，选取此区域引入半胱氨酸残基。78位到82位的氨基酸分别为78天冬氨酸(Asp)、79脯氨酸(Pro)、80丙氨酸(Ala)、81丝氨酸(Ser)、82精氨酸(Arg)，通过分析5个氨基酸的理化性质，以及氨基酸改变后对蛋白结构的影响，将80位丙氨酸变为半胱氨酸带来的结构改变最小，是最佳的选择(图4)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]由乙肝病毒核心蛋白（HBc-VLP）递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究[J]. 张旭凡,胡发彪,马兴元,王天文,王平,王晓丽. 中国生物工程杂志. 2016(02)
[2]M2e-HBC融合蛋白的真核表达[J]. 刘蕊,李志奎. 陕西医学杂志. 2011(09)
本文编号：3058853
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