人艰难梭菌毒素B抗原表位抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

发布时间：2021-03-09 02:15

　　目的制备人艰难梭菌TcdB抗原表位抗体,建立针对人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA检测方法。方法通过生物信息学等方法预测人艰难梭菌TcdB蛋白的抗原表位,固相多肽合成法合成抗原并制备抗体Anti-TcdB1和Anti-TcdB2,ELISA检测效价并验证其特异性。用辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）标记TcdB2抗体,建立ELISA双抗体夹心法。利用棋盘滴定法筛选一抗最佳包被浓度、最佳样品稀释倍数及最适二抗工作浓度等条件,优化ELISA检测方法并确定临界值,用已知阳性、阴性标本及重组B蛋白验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。结果间接ELISA确定Anti-TcdB1的效价为1∶512 000,抗TcdB2抗体为1∶2 048 000。棋盘滴定等方法确定ELISA一抗最佳包被浓度0.5μg/ml,样品最佳稀释倍数1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶20 000。该诊断方法特异,不与其它肠道细菌感染出现交叉反应;重组B蛋白最低检测限为32.25ng/ml;试验的重复性良好,批内和批间变异系数均小于10%。结论本研究建立的检测人艰难梭菌TcdB的ELISA... 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2020,15(03)北大核心

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【部分图文】：

Protean表位抗原预测结果

对结合protean(DNAstar）软件分析TcdB全序列的亲水性、表面可接触性、弹性、抗原倾向性等条件分析（图1），二级结构预测其β转角、无规则卷曲为凸出结构，暴露于蛋白质抗原的可能性大，且利于抗原抗体嵌合，适合作为抗原表位。抗原决定簇进行系统评价，确定以TcdB1 2085-2097(DGSKYYFDED-TAE),TcdB2 2308-2322(HQNTLDENFEGESIN）为表位抗原。通过SWISS-model的三级结构建模（图2）进一步验证抗原决定簇的优劣性，可见其位于抗原表面，且具有较好的嵌合结构，可作为抗原决定簇。2 Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的效价

采用ELISA棋盘滴定法测定抗体Anti-TcdB1最适包被浓度和样品最佳稀释度结果见表3。抗体最佳包被浓度为0.5μg/ml，样品最佳稀释倍数为1∶2，此时的S/N值最大为3.82。图5 HRP-Anti-TcdB2最适工作浓度


本文编号：3072073