肌酐酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达及分泌机制
发布时间：2021-03-08 16:13
肌酐酶是用于临床检测肾小球滤过功能的关键酶之一,但目前国内肌酐酶的生产量较低无法满足市场需求,多依赖于国外进口。为了解决这一问题,本研究将恶臭假单胞杆菌肌酐酶基因克隆至原核表达载体p MA5实现肌酐酶在枯草芽孢杆菌1A751中的异源表达。随后通过启动子优化,使肌酐酶的蛋白表达量显著提高到1.08mg/mL,并且胞外肌酐酶的比酶活力达到238U/mg。同时发现肌酐酶可不依赖于信号肽即可实现胞外分泌,因此对肌酐酶在枯草芽孢杆菌中的分泌机制进行研究。通过对经典分泌途径和Holin途径的分析排除、利用Calcein-AM/PI双染色法鉴定表达菌株1AGC的细胞膜不完整,最后通过电子显微镜观察结果表明表达菌株表面存在潜在的泄漏位点,因此证实肌酐酶在枯草芽孢杆菌中通过细胞泄漏的方式,释放到胞外培养基中。本文构建了一株基于细胞泄漏的肌酐酶高产菌株,为肌酐酶的表达和潜在工业化应用提供理论基础,同时也为枯草芽孢杆菌泄漏表达系统提供了一定的研究基础。
【文章来源】：化工进展. 2020,39(04)北大核心
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
Holin蛋白验证分析结果
菌株1A751H和1AGC的染色结果
启动子强度的不同，可以影响目的基因的转录程度，进而影响外源蛋白在宿主菌株中的表达水平。为得到肌酐酶在枯草芽孢杆菌中合适的转录水平，通过组内已有的蛋白研究，选用麦芽糖诱导型启动子Pglv来代替pMA5的组成型启动子PHpaⅡ[17]，从而构建了麦芽糖诱导型表达质粒pMGC。同时依靠组成型启动子PhpaⅡ的重组肌酐酶表达质粒pMA5-CR也进行构建。质粒p MA5-CR和pMGC的验证结果见图1，约在1200bp和1500bp处有明亮单一的条带，与软件预测的理论条带大小一致。将验证正确的菌液接种于试管中培养12～14h，提取质粒，送往金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果用SnapGene软件进行分析比对，进而获得带有肌酐酶目的基因的重组表达质粒pMA5-CR和pMGC。将质粒p MA5-CR、pMGC和pMA5转入B.subtilis 1A751进而构建表达菌株1AHC、1AGC和对照菌株1A751H，摇瓶培养后的SDS-PAGE分析结果见图2。通过SnapGene软件分析预测肌酐酶的理论蛋白分子量为30000，图2中，可明显观测到菌株1AGC与1AHC在30000处存在条带，与理论预测的蛋白分子量大小一致，同时可明显观察到麦芽糖诱导型菌株1AGC的表达量明显高于组成型启动子表达菌株1AHC。此外，从图2(a)的摇瓶培养结果可分析出在24h时肌酐酶主要以胞内可溶的形式存在逐步积累在细胞内部。而从图2(b)的结果来看，随培养时间增加到48h时，胞外肌酐酶的蛋白量逐渐增加，胞内可溶组分减少，这表明肌酐酶在枯草芽孢杆菌中不依赖于信号肽即可分泌到胞外培养基中。在通过启动子优化提高蛋白表达量的同时，出现少量错误折叠的蛋白即包涵体，很大程度是由于部分蛋白折叠中间体错误聚集形成的，在后续的实验中可以考虑调节启动子强度、降低培养温度等手段进行调节。
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽胞杆菌蛋白质表达分泌系统发展及展望[J]. 张大伟,康倩. 微生物学杂志. 2019(01)
[2]hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化[J]. 韩平,盖园明,朱蓓薇,张大伟. 生物技术进展. 2018(03)
[3]恶臭假单胞杆菌肌酐酶在大肠杆菌中的表达及其酶学特性分析[J]. 侯赣生,林影,梁书利. 现代食品科技. 2017(09)
[4]肌酐水解酶基因工程菌的构建及功能研究[J]. 杨波,蒋芬,朱艳,杨成,向铁勇,段绍斌,蒋云生. 中南医学科学杂志. 2016(05)
[5]双乙酰-肌酸-CTMAB体系共振光散射法测定尿中痕量α-萘酚[J]. 袁康秀,袁玉坤,史林飞,周斌,王永生. 应用化工. 2011(06)
[6]产肌酐水解酶基因工程菌的构建[J]. 程新,张彦新,周桂凤,蒋云生. 生物医学工程研究. 2009(04)
硕士论文
[1]α-淀粉酶的异源表达、调控元件优化和分泌瓶颈鉴定[D]. 陈景奇.天津大学 2015
本文编号：3071311
【文章来源】：化工进展. 2020,39(04)北大核心
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
Holin蛋白验证分析结果
菌株1A751H和1AGC的染色结果
启动子强度的不同，可以影响目的基因的转录程度，进而影响外源蛋白在宿主菌株中的表达水平。为得到肌酐酶在枯草芽孢杆菌中合适的转录水平，通过组内已有的蛋白研究，选用麦芽糖诱导型启动子Pglv来代替pMA5的组成型启动子PHpaⅡ[17]，从而构建了麦芽糖诱导型表达质粒pMGC。同时依靠组成型启动子PhpaⅡ的重组肌酐酶表达质粒pMA5-CR也进行构建。质粒p MA5-CR和pMGC的验证结果见图1，约在1200bp和1500bp处有明亮单一的条带，与软件预测的理论条带大小一致。将验证正确的菌液接种于试管中培养12～14h，提取质粒，送往金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果用SnapGene软件进行分析比对，进而获得带有肌酐酶目的基因的重组表达质粒pMA5-CR和pMGC。将质粒p MA5-CR、pMGC和pMA5转入B.subtilis 1A751进而构建表达菌株1AHC、1AGC和对照菌株1A751H，摇瓶培养后的SDS-PAGE分析结果见图2。通过SnapGene软件分析预测肌酐酶的理论蛋白分子量为30000，图2中，可明显观测到菌株1AGC与1AHC在30000处存在条带，与理论预测的蛋白分子量大小一致，同时可明显观察到麦芽糖诱导型菌株1AGC的表达量明显高于组成型启动子表达菌株1AHC。此外，从图2(a)的摇瓶培养结果可分析出在24h时肌酐酶主要以胞内可溶的形式存在逐步积累在细胞内部。而从图2(b)的结果来看，随培养时间增加到48h时，胞外肌酐酶的蛋白量逐渐增加，胞内可溶组分减少，这表明肌酐酶在枯草芽孢杆菌中不依赖于信号肽即可分泌到胞外培养基中。在通过启动子优化提高蛋白表达量的同时，出现少量错误折叠的蛋白即包涵体，很大程度是由于部分蛋白折叠中间体错误聚集形成的，在后续的实验中可以考虑调节启动子强度、降低培养温度等手段进行调节。
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽胞杆菌蛋白质表达分泌系统发展及展望[J]. 张大伟,康倩. 微生物学杂志. 2019(01)
[2]hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化[J]. 韩平,盖园明,朱蓓薇,张大伟. 生物技术进展. 2018(03)
[3]恶臭假单胞杆菌肌酐酶在大肠杆菌中的表达及其酶学特性分析[J]. 侯赣生,林影,梁书利. 现代食品科技. 2017(09)
[4]肌酐水解酶基因工程菌的构建及功能研究[J]. 杨波,蒋芬,朱艳,杨成,向铁勇,段绍斌,蒋云生. 中南医学科学杂志. 2016(05)
[5]双乙酰-肌酸-CTMAB体系共振光散射法测定尿中痕量α-萘酚[J]. 袁康秀,袁玉坤,史林飞,周斌,王永生. 应用化工. 2011(06)
[6]产肌酐水解酶基因工程菌的构建[J]. 程新,张彦新,周桂凤,蒋云生. 生物医学工程研究. 2009(04)
硕士论文
[1]α-淀粉酶的异源表达、调控元件优化和分泌瓶颈鉴定[D]. 陈景奇.天津大学 2015
本文编号：3071311
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