改良原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养方法及鉴定
发布时间：2021-03-24 05:37
目的改良原代大鼠脑微血管内皮细胞分离培养方法。方法选取4～6周龄SD大鼠6只,经开颅取脑、漂洗剪碎、过筛、牛血清白蛋白密度梯度离心、Ⅱ型胶原酶及胶原酶-分散酶两次连续酶消化后进行原代培养。通过细胞形态学观察和第Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果体外培养12～24 h后,细胞以贴壁的脑微血管段为中心,放射状向外周移行,并逐渐扩大成团簇状;细胞融合后则呈典型的单层、扁平、"铺路石样"镶嵌式排列。第Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,胞质呈棕红色,表达为阳性,阳性细胞率达99%以上。结论改良方法能够成功高效分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。
【文章来源】：解剖学报. 2020,51(01)北大核心CSCD
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
岛屿状细胞团簇逐渐融合形成铺路石样排列A～E．标尺示100μm;F．标尺示200μm
图2 岛屿状细胞团簇逐渐融合形成铺路石样排列A～E．标尺示100μm;F．标尺示200μm接种足够数量的脑微血管段，是发挥细胞群体优势、保证大鼠BMECs成活的关键。我们认为，在100倍光学显微镜视野下，微血管段的接种数量应达到20～30根为宜。为了获得该数量的脑微血管段，课题组将实验大鼠的样本数量从常规的2～4只，增加到了6只及以上。同时，针对化学酶消化法这一解离和培养原代大鼠BMECs的重要技术环节，我们还对酶法的运用、酶类的选择以及作用时间等进行了反复实践和探索。如在酶法的运用上，联合选用了Ⅱ型胶原酶和胶原酶-分散酶作为主要消化酶，采用连续消化方法。这完全不同于鹿文葆[5]、查雨锋[6,7]等运用单一的Ⅱ型胶原酶或胶原酶-分散酶进行消化，其优点在于消化作用彻底，缩短了消化时间，节约了昂贵的胶原酶-分散酶，同时还达到了保护内皮细胞，提高接种存活率，分散杂细胞的目的。此外，由于胶原酶对BMECs的消化作用特点是由血管外层向里层逐步推进，最后消化剩余的细胞才是内皮细胞，故充分消化脑微血管段是获得足够数量BMECs的前提[8]。即消化液的量以每只大鼠脑1～2 ml为宜，常用工作浓度为0.1%或0.2%[9]。作用时间以倒置相差显微镜下观察到短棍状的微血管段被消化成串珠样或桑葚样改变时为准。
BMECs是开展探索脑发育、认知脑功能、构建血脑屏障模型、预防脑卒中、康复脑功能、延缓脑动脉粥样硬化、护脑延缓衰老等研究的重要载体，是运用价值较大的研究脑生理、病理的工具细胞。课题组在前期预实验的基础上[4]，围绕如何增加大鼠脑微血管段的接种数量以及提高BMECs的活性质量问题，对受试动物的选择、微血管段的获得以及酶消化法的运用等进行了积极改良和实践。图2 岛屿状细胞团簇逐渐融合形成铺路石样排列A～E．标尺示100μm;F．标尺示200μm
【参考文献】：
期刊论文
[1]原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定[J]. 马华根,唐元瑜,纪立金. 解剖学杂志. 2018(03)
[2]小鼠脑微血管内皮细胞的分离培养与鉴定[J]. 宋晓彬,范春娥,王烨,张艺腾,崔丛丛,曾卫卫,郑丽蓉,蔡晓洁,陈华群. 南京师大学报(自然科学版). 2017(03)
[3]一种高纯度和高活力的大鼠脑微血管内皮细胞的提取及原代培养方法[J]. 查雨锋,张顺,苏航,刘亭,傅晓钟,董永喜,王爱民,王永林. 中国药理学通报. 2014(11)
[4]大鼠脑微血管内皮细胞的纯化培养与鉴定[J]. 鹿文葆,秦伟伟,刘淑英,李宏伟,修瑞娟. 中国脑血管病杂志. 2011(10)
[5]大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较[J]. 田林郁,李胜富,周东. 四川大学学报(医学版). 2010(05)
[6]大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养及鉴定[J]. 郭洋,伊鹏霏,吕钊君,白慧云,韦旭斌,杜绍范,穆祥. 沈阳农业大学学报. 2010(02)
[7]微血管内皮细胞的培养及其在医学研究中的应用[J]. 娄晋宁. 微循环学杂志. 2004(03)
[8]牛脉络膜微血管内皮细胞的分离培养和鉴定[J]. 詹永乐,李维业. 解剖学报. 1997(03)
本文编号：3097164
【文章来源】：解剖学报. 2020,51(01)北大核心CSCD
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
岛屿状细胞团簇逐渐融合形成铺路石样排列A～E．标尺示100μm;F．标尺示200μm
图2 岛屿状细胞团簇逐渐融合形成铺路石样排列A～E．标尺示100μm;F．标尺示200μm接种足够数量的脑微血管段，是发挥细胞群体优势、保证大鼠BMECs成活的关键。我们认为，在100倍光学显微镜视野下，微血管段的接种数量应达到20～30根为宜。为了获得该数量的脑微血管段，课题组将实验大鼠的样本数量从常规的2～4只，增加到了6只及以上。同时，针对化学酶消化法这一解离和培养原代大鼠BMECs的重要技术环节，我们还对酶法的运用、酶类的选择以及作用时间等进行了反复实践和探索。如在酶法的运用上，联合选用了Ⅱ型胶原酶和胶原酶-分散酶作为主要消化酶，采用连续消化方法。这完全不同于鹿文葆[5]、查雨锋[6,7]等运用单一的Ⅱ型胶原酶或胶原酶-分散酶进行消化，其优点在于消化作用彻底，缩短了消化时间，节约了昂贵的胶原酶-分散酶，同时还达到了保护内皮细胞，提高接种存活率，分散杂细胞的目的。此外，由于胶原酶对BMECs的消化作用特点是由血管外层向里层逐步推进，最后消化剩余的细胞才是内皮细胞，故充分消化脑微血管段是获得足够数量BMECs的前提[8]。即消化液的量以每只大鼠脑1～2 ml为宜，常用工作浓度为0.1%或0.2%[9]。作用时间以倒置相差显微镜下观察到短棍状的微血管段被消化成串珠样或桑葚样改变时为准。
BMECs是开展探索脑发育、认知脑功能、构建血脑屏障模型、预防脑卒中、康复脑功能、延缓脑动脉粥样硬化、护脑延缓衰老等研究的重要载体，是运用价值较大的研究脑生理、病理的工具细胞。课题组在前期预实验的基础上[4]，围绕如何增加大鼠脑微血管段的接种数量以及提高BMECs的活性质量问题，对受试动物的选择、微血管段的获得以及酶消化法的运用等进行了积极改良和实践。图2 岛屿状细胞团簇逐渐融合形成铺路石样排列A～E．标尺示100μm;F．标尺示200μm
【参考文献】：
期刊论文
[1]原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定[J]. 马华根,唐元瑜,纪立金. 解剖学杂志. 2018(03)
[2]小鼠脑微血管内皮细胞的分离培养与鉴定[J]. 宋晓彬,范春娥,王烨,张艺腾,崔丛丛,曾卫卫,郑丽蓉,蔡晓洁,陈华群. 南京师大学报(自然科学版). 2017(03)
[3]一种高纯度和高活力的大鼠脑微血管内皮细胞的提取及原代培养方法[J]. 查雨锋,张顺,苏航,刘亭,傅晓钟,董永喜,王爱民,王永林. 中国药理学通报. 2014(11)
[4]大鼠脑微血管内皮细胞的纯化培养与鉴定[J]. 鹿文葆,秦伟伟,刘淑英,李宏伟,修瑞娟. 中国脑血管病杂志. 2011(10)
[5]大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较[J]. 田林郁,李胜富,周东. 四川大学学报(医学版). 2010(05)
[6]大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养及鉴定[J]. 郭洋,伊鹏霏,吕钊君,白慧云,韦旭斌,杜绍范,穆祥. 沈阳农业大学学报. 2010(02)
[7]微血管内皮细胞的培养及其在医学研究中的应用[J]. 娄晋宁. 微循环学杂志. 2004(03)
[8]牛脉络膜微血管内皮细胞的分离培养和鉴定[J]. 詹永乐,李维业. 解剖学报. 1997(03)
本文编号：3097164
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