CRISPR/Cas9技术构建Vegf-b敲除斑马鱼模型和心血管发育异常的初探

发布时间：2021-03-24 06:20

　　目的使用CRISPR/Cas9技术构建血管内皮生长因子b（Vascular endothelial growth factor b,Vegfb）敲除斑马鱼模型。方法设计CRISPR/Cas9位点,体外转录单链向导RNA（single guide RNA,sg RNA）和Cas9 RNA,通过斑马鱼受精卵显微注射,评价sg RNA效率。对子代斑马鱼进行基因测序并筛选,最后获得基因敲除的纯合子斑马鱼Vegf-b-/-。结果针对1个基因位点设计并构建了2个sg RNA,选择效率最高的sg RNA1进行斑马鱼受精卵显微注射,获得嵌合体F0代胚胎,筛选出稳定遗传的founder。并进一步通过三代筛选鉴定获得可稳定遗传的Vegf-b敲除的斑马鱼系,通过荧光显微镜观察发现其血管发育和心脏形态异常。结论通过CRISPR/Cas9技术,可以稳定可靠的构建Vegf-b基因敲除斑马鱼,并证明Vegf-b影响斑马鱼体节间血管的发育和心脏功能,为后续Vegf-b功能研究奠定了重要的基础。 

【文章来源】：广东药科大学学报. 2020,36(02)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

基因敲除斑马鱼模型的构建过程

测序结果显示，sg RNA1(图2 A)出现明显的套峰，且重叠峰出现在Vegf-b靶位点(黑色线框所标注的序列)酶切位点附近，而sgRNA2为单峰(图2B)，确定sg RNA1诱导突变有效，因此，本研究使用sgRNA1进行下一步的实验。3.2 Vegf-b敲除斑马鱼的构建及筛选

F0代嵌合体成年后与同品系的野生型杂交，胚胎通过碱裂法测序，不能稳定遗传的F0代只有单峰，可以稳定遗传的有明显套峰，称之为founder(图3 A)。让founder与野生型杂交获得F1代，待F1代成年后用碱裂法测序，没有基因突变的野生型只有单峰，有基因突变的斑马鱼杂合子Vegf-b+/-有明显套峰(图3 B)。对F1代敲除杂合子进行基因克隆测序，发现其基因序列缺失TC 2 bp碱基(图3 C)。让缺失TC 2 bp的F1代杂合子和野生型杂交获得F2代，待F2代成年后用相同方法筛选出基因型相同的F2代敲除杂合子，野生型只有单峰，F2代敲除杂合子有明显套峰(图3 D)。让F2代敲除杂合子Vegf-b+/-自交，相同的方法进行筛选，发现杂合子Vegf-b+/-有明显套峰，没有基因突变的野生型或者有基因突变的纯合子Vegf-b-/-(图3 E)只有单峰，进一步通过序列比对发现，野生型碱基没有缺失，纯合子Vegf-b-/-缺失TC 2 bp碱基(图3 F)。最终获得可稳定遗传的Vegf-b敲除的斑马鱼系。3.3 斑马鱼胚胎心血管发育评价

【参考文献】：
期刊论文
[1]模式生物斑马鱼在听觉领域的应用[J]. 刘可春,高燕,张云,何秋霞,韩利文,李宁,季秀娜,孙晨.  山东科学. 2019(05)
[2]跑台运动对高脂饮食喂养的肥胖小鼠比目鱼肌脂质沉积和血管内皮生长因子B表达的影响[J]. 张靓,马谨,高海宁,李灵杰.  中国运动医学杂志. 2017(09)



本文编号：3097229