Tudor-SN通过调控染色质重塑促进DNA损伤修复的分子机制
发布时间：2021-03-25 22:26
目的:人体在自然条件下,会被环境中各种刺激因素以及细胞内源性应激造成DNA发生损伤,严重影响了细胞内信息遗传和基因编码的方式。在遭受刺激后,细胞会通过激活一套完整精细的过程,包括DNA断裂识别,检查点的激活,染色质重塑,DNA修复,周期阻滞和细胞凋亡等,防止错误信息影响细胞自身功能,维护基因组的稳定性,保护机体功能的正常运行。Tudor-SN（Tudor staphylococcal nuclease）作为一个转录共激活因子,在很多细胞进程中发挥作用,比如:pre-mRNA剪接加工,细胞周期调控,应激颗粒形成,脂质代谢,肿瘤侵袭迁移等。近期研究报道,Tudor-SN与细胞凋亡以及化疗药物抵抗密切相关。我们实验室前期结果也发现Tudor-SN可以与一些损伤修复蛋白结合,但其作用和具体机制尚不明确。本课题主要目的是探讨Tudor-SN在DNA损伤修复中的功能及其分子机制。方法:本课题主要分六部分进行:第一部分,在不同细胞系中观察Tudor-SN与损伤修复蛋白的结合情况。首先采用质谱技术,在IR后用Tudor-SN蛋白钓取损伤修复相关蛋白,然后在Hela和MEF细胞中利用免疫共沉淀方法进一步...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：119 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
1：Tudor-SN与多种损伤修复蛋白结合为了进一步确认Tudor-SN在质谱中的钓取结果，我们在MEF和HeLa细胞
图 2.1.2：Tudor-SN 与多种损伤修复蛋白内源性结合Tudor-SN 在 IR 后细胞存活中发挥重要作用细胞在遭受 DNA 损伤后会激活体内各种修复机制，保护自身基因组的待修复完成后，重新进入周期存活下去，但是如果不能很好的修复则最后死亡，前面的结果提示我们 Tudor-SN 可以与多种损伤修复蛋白结作为一个新的损伤修复蛋白，那 Tudor-SN 的缺失是否会导致 IR 后细发生改变？为了检测Tudor-SN 在细胞IR后的生理功能，我们利用MEF-WT和ME系，用 MTT 实验检测细胞在 IR 后的存活率。如结果所示，首先用 weting 验证 MEF-WT 和 MEF-KO 细胞中 Tudor-SN 的表达，结果显示 KOor-SN 蛋白被完全敲除，接下来将两组细胞分别给予不同剂量（0，2，4）IR 照射，然后用胰酶消化成单细胞悬液，取 5000 个细胞铺 96 孔板， 5 个复孔，继续培养三天后，利用 MTT 检测试剂盒检测细胞的活性，
图 2.2.1：Tudor-SN 敲除，MEF-KO 细胞在 IR 后存活率降低为了进一步确认 Tudor-SN 是否会影响细胞对IR的敏感性，我们用MEF-WT和 MEF-KO 细胞，给予不同剂量（0，2，3，4，5Gy）IR 照射后，用胰酶消化细胞制成单细胞悬浮液，每皿取 5000 个细胞铺于 6cm皿中培养 10-14 天，当发现肉眼可见克隆斑后，清洗培养皿，固定细胞后用结晶紫染色，随后洗净拍照，并在显微镜下观察克隆斑的形成并计数。我们将未照射组的细胞克隆数量设定为 1，同样算法计算出其他每皿细胞克隆斑的比例，根据克隆斑比例做折线图，统计分析各组间差异。结果显示两组细胞中，MEF-WT 组细胞在 IR 后随着剂量的增加，克隆斑的形成有减少，而 MEF-KO 组中随着 IR 剂量增加，克隆斑数量减少更明显，提示我们MEF-KO 组细胞IR后活性较低，克隆形成能力明显较弱，根据克隆斑比率计算成活率，采用 t 检验分析，*P<0.05 (n=3)，**P<0.01 (n=3统计结果有显著差异。这说明Tudor-SN 敲除后细胞对IR照射更敏感（图2.2.2）。
本文编号：3100437
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：119 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
1：Tudor-SN与多种损伤修复蛋白结合为了进一步确认Tudor-SN在质谱中的钓取结果，我们在MEF和HeLa细胞
图 2.1.2：Tudor-SN 与多种损伤修复蛋白内源性结合Tudor-SN 在 IR 后细胞存活中发挥重要作用细胞在遭受 DNA 损伤后会激活体内各种修复机制，保护自身基因组的待修复完成后，重新进入周期存活下去，但是如果不能很好的修复则最后死亡，前面的结果提示我们 Tudor-SN 可以与多种损伤修复蛋白结作为一个新的损伤修复蛋白，那 Tudor-SN 的缺失是否会导致 IR 后细发生改变？为了检测Tudor-SN 在细胞IR后的生理功能，我们利用MEF-WT和ME系，用 MTT 实验检测细胞在 IR 后的存活率。如结果所示，首先用 weting 验证 MEF-WT 和 MEF-KO 细胞中 Tudor-SN 的表达，结果显示 KOor-SN 蛋白被完全敲除，接下来将两组细胞分别给予不同剂量（0，2，4）IR 照射，然后用胰酶消化成单细胞悬液，取 5000 个细胞铺 96 孔板， 5 个复孔，继续培养三天后，利用 MTT 检测试剂盒检测细胞的活性，
图 2.2.1：Tudor-SN 敲除，MEF-KO 细胞在 IR 后存活率降低为了进一步确认 Tudor-SN 是否会影响细胞对IR的敏感性，我们用MEF-WT和 MEF-KO 细胞，给予不同剂量（0，2，3，4，5Gy）IR 照射后，用胰酶消化细胞制成单细胞悬浮液，每皿取 5000 个细胞铺于 6cm皿中培养 10-14 天，当发现肉眼可见克隆斑后，清洗培养皿，固定细胞后用结晶紫染色，随后洗净拍照，并在显微镜下观察克隆斑的形成并计数。我们将未照射组的细胞克隆数量设定为 1，同样算法计算出其他每皿细胞克隆斑的比例，根据克隆斑比例做折线图，统计分析各组间差异。结果显示两组细胞中，MEF-WT 组细胞在 IR 后随着剂量的增加，克隆斑的形成有减少，而 MEF-KO 组中随着 IR 剂量增加，克隆斑数量减少更明显，提示我们MEF-KO 组细胞IR后活性较低，克隆形成能力明显较弱，根据克隆斑比率计算成活率，采用 t 检验分析，*P<0.05 (n=3)，**P<0.01 (n=3统计结果有显著差异。这说明Tudor-SN 敲除后细胞对IR照射更敏感（图2.2.2）。
本文编号：3100437
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