海马与新皮质组织特异性GABRG2基因敲除小鼠模型的构建及其在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症中的初步研究

发布时间：2021-04-03 06:30

　　建立基于Cre/loxp重组酶系统调控的海马和新皮质特异性GABA_A受体γ2亚基（GABRG2）基因条件基因敲除小鼠模型,为深入研究海马区和新皮质GABRG2在癫痫发生中的功能作用提供动物模型。将引进的GABRG2^fl/wt转基因小鼠与海马和新皮质特异性表达Cre⁺/+重组酶工具鼠分别进行繁配和鉴定,然后再将2种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为GABRG2^fl/wtCre⁺的小鼠为构建的海马区和新皮质特异性GABRG2基因条件性敲除小鼠。利用PCR技术鉴定小鼠基因型,Real-Time PCR和Western blot技术检测GABRG2基因在小鼠海马和新皮质中的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。PCR结果显示子代小鼠基因型符合GABRG2^fl/wtCre⁺;海马与新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠海马和新皮质中GABRG2的mRNA水平和蛋白质水平显著低于对照组;热造模过程中,实验组小鼠癫痫发作更明显。... 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(03)北大核心CSCD

【文章页数】：12 页

【部分图文】：

海马和新皮质组织特异性GABRG2基因敲除小鼠构建策略

GABRG2fl/wtCre+小鼠鉴定分两部分，第一部分鉴定GABRG2fl/wt，第二部分鉴定Cre+，二者均为阳性则是GABRG2fl/wtCre+基因型试验组小鼠，鉴定PCR引物见表2。鉴定时除剪脚趾提取基因组DNA外，在获得的GABRG2fl/wtCre+小鼠中随机选择一只取海马和新皮质，提取基因组DNA进行PCR反应，鉴定组织flox区域已经删除。1.2.4 PCR反应与琼脂糖凝胶电泳

对F0代小鼠与背景鼠回交，繁殖生育F1代，筛选出GABRG2fl/fl小鼠或GABRG2fl/wt小鼠。对F1代小鼠进行基因型鉴定，部分结果见图3，基因型鉴定引物见表1。使用引物1进行PCR筛选时，GARG2 flox纯合子小鼠显示一条248bp条带，野生型条带为158bp，杂合子为两条带;引物2 PCR扩增后，纯合子扩增片段条带为294bp，野生型为201bp，杂合子为两条带;使用引物3 PCR后，含有flox的小鼠扩增条带为534bp，野生型则无;同样引物4 PCR后，含有flox的小鼠扩增条带为588bp，野生型则无;分别使用引物5和引物6进行PCR扩增后，含flox的小鼠分别扩增出1 962bp和2 013bp的条带，野生型则无此条带。同时满足此6个位点鉴定正确的小鼠为本研究使用的目的小鼠。本实验中所得到的4只小鼠(雌、雄各2只)均为杂合型GABRG2fl/wt小鼠。鉴定过程中，仅F0代及F1代需鉴定6个位点并测序，F1代小鼠后代鉴定方案为5"初筛或3"初筛引物、D5-5引物、D3-3引物，不需测序。2.2 表达Cre重组酶小鼠的繁殖及鉴定


本文编号：3116802